Cancro Cervicale e Radioterapia: Svelato il Ruolo Chiave di HSP90 nel Difendere le Cellule Tumorali!

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di qualcosa di veramente affascinante che sta emergendo nel campo della lotta contro il cancro, in particolare quello cervicale. Come sapete, il carcinoma a cellule squamose della cervice (CESC) è uno dei tumori più comuni tra le donne, e la radioterapia è spesso la prima linea di difesa, soprattutto nei casi localmente avanzati. Il problema? Beh, spesso le cellule tumorali sviluppano una resistenza, intrinseca o acquisita, alle radiazioni, rendendo la terapia meno efficace e portando a prognosi non proprio rosee. È una sfida enorme che affrontiamo in clinica.

Il Mistero della Resistenza alle Radiazioni

La radioterapia funziona danneggiando il DNA delle cellule tumorali, in particolare causando rotture del doppio filamento (DSBs). Questo danno dovrebbe portare le cellule alla morte, ma non sempre accade. Esistono diversi modi in cui una cellula può morire, e recentemente ne è stato identificato uno nuovo chiamato ferroptosi. Si tratta di una morte cellulare programmata che dipende dal ferro e dall’accumulo di perossidi lipidici tossici. Molti studi suggeriscono che indurre la ferroptosi potrebbe essere una strategia promettente per potenziare trattamenti come la radioterapia. Tuttavia, nel contesto del cancro cervicale, il legame tra radioterapia e ferroptosi era ancora tutto da definire.

Un Attore Inaspettato: Deossicitidina Chinasi (dCK)

Qui entra in gioco una proteina che ho studiato a fondo: la Deossicitidina Chinasi, o dCK. È un enzima chiave nel “riciclo” dei nucleosidi, fornendo i mattoni (i deossinucleotidi trifosfati) per la replicazione e la riparazione del DNA. È anche fondamentale per attivare molti farmaci chemioterapici analoghi dei nucleosidi, spesso usati in combinazione con la radioterapia. Nel nostro lavoro precedente, avevamo notato qualcosa di strano: la dCK sembrava inibire la morte cellulare indotta dalle radiazioni ionizzanti (IR), inclusa l’apoptosi e la catastrofe mitotica. Non solo, avevamo scoperto tramite spettrometria di massa e co-immunoprecipitazione che dCK interagisce con un’altra proteina molto importante: HSP90.

Nel nostro studio più recente, abbiamo fatto un passo avanti. Abbiamo scoperto che la dCK, in realtà, inibisce la ferroptosi indotta dalle radiazioni! E come lo fa? Aumentando l’attività e la stabilità di un’altra proteina chiamata SLC7A11, che agisce come un “difensore” contro la ferroptosi. Analizzando i dati del database The Cancer Genome Atlas (TCGA), abbiamo visto che i livelli di dCK sono significativamente più alti nei tessuti tumorali cervicali rispetto a quelli normali. E non è tutto: alti livelli di dCK sono correlati a una prognosi peggiore per le pazienti. Quando abbiamo esposto le cellule HeLa (una linea cellulare di cancro cervicale) a radiazioni, abbiamo visto che l’espressione di dCK aumentava nel tempo.

Per capire meglio il ruolo di dCK, abbiamo creato cellule HeLa in cui l’espressione di dCK era stata “silenziata” (knockdown). E voilà! Queste cellule con meno dCK morivano molto di più dopo l’esposizione alle radiazioni. Non solo, erano anche molto più sensibili alla radioterapia, come dimostrato dalla loro ridotta capacità di formare colonie. Questo ci ha suggerito che “spegnere” dCK potesse aumentare l’efficacia delle radiazioni.

dCK e Ferroptosi: Un Legame Stretto

Ma che tipo di morte cellulare veniva favorita dalla mancanza di dCK? Abbiamo usato diversi inibitori specifici: Z-VAD per l’apoptosi, Ferrostatin-1 (Fer-1) per la ferroptosi e Clorochina (CQ) per l’autofagia. Il risultato più eclatante è stato che Fer-1 riusciva a ridurre significativamente la morte cellulare indotta dalle radiazioni nelle cellule con dCK knockdown. Questo era un indizio forte: la dCK stava proteggendo le cellule proprio dalla ferroptosi!

Per confermarlo, abbiamo fatto altri test. La ferroptosi dipende dal ferro (Fe2+). Ebbene, le cellule con meno dCK avevano livelli di Fe2+ intracellulare significativamente più alti, effetto amplificato dalle radiazioni. Inoltre, la perossidazione lipidica (un segno distintivo della ferroptosi, misurata con BODIPY C11) era molto aumentata nelle cellule dCK-knockdown dopo irradiazione o trattamento con erastina (un induttore di ferroptosi), e questo aumento poteva essere bloccato da Fer-1. Abbiamo anche visto che i marcatori molecolari della ferroptosi seguivano lo stesso schema: PTGS2 (un marcatore pro-ferroptosi) aumentava, mentre GPX4 (un difensore chiave contro la ferroptosi) diminuiva nelle cellule con meno dCK dopo l’irradiazione. Insomma, tutti gli indizi puntavano nella stessa direzione: la dCK reprime la ferroptosi indotta da radiazioni.

Come dCK Controlla la Ferroptosi: Il Ruolo di SLC7A11

Ma come fa dCK a regolare la ferroptosi? Abbiamo scoperto che la mancanza di dCK portava a una riduzione dei livelli di diverse proteine legate alla ferroptosi, in particolare di SLC7A11. Abbiamo confermato che SLC7A11 è cruciale in questo processo: ripristinare i suoi livelli nelle cellule dCK-knockdown riduceva la perossidazione lipidica e la morte cellulare. Non solo, abbiamo dimostrato con esperimenti di immunoprecipitazione (IP) che dCK e SLC7A11 interagiscono fisicamente.

Abbiamo poi indagato come dCK influenzasse la stabilità di SLC7A11. Usando la cicloesimide (CHX), che blocca la sintesi di nuove proteine, abbiamo visto che nelle cellule con meno dCK, la proteina SLC7A11 veniva degradata molto più velocemente (la sua emivita era ridotta). Curiosamente, i livelli di mRNA di SLC7A11 non cambiavano molto con il knockdown o l’overespressione di dCK, suggerendo un controllo post-trascrizionale. Ma c’era di più! Abbiamo scoperto che dCK poteva anche aumentare l’attività trascrizionale del promotore di SLC7A11, probabilmente tramite un fattore di trascrizione chiamato ESR1. Abbiamo trovato una correlazione positiva tra dCK ed ESR1 nel cancro cervicale e visto che il knockdown di dCK riduceva l’mRNA di ESR1. Esperimenti con reporter luciferasi hanno confermato che ESR1 regola direttamente la trascrizione di SLC7A11. Quindi, dCK sembra potenziare SLC7A11 sia a livello trascrizionale (tramite ESR1) sia post-trascrizionale (aumentandone la stabilità).

HSP90: Il Regista Occulto della Stabilità di dCK

Ricordate che avevamo trovato un legame tra dCK e HSP90? HSP90 è una proteina “chaperone”, aiuta cioè altre proteine a mantenere la loro forma e funzione corretta. È molto studiata nel cancro perché spesso aiuta le proteine tumorali a sopravvivere. Abbiamo confermato una correlazione positiva tra dCK e HSP90AA1 (una forma di HSP90) nei dati TCGA. Abbiamo quindi usato un inibitore di HSP90, il Tanespimycin (17-AAG). Trattando le cellule HeLa con 17-AAG, abbiamo visto che i livelli sia di HSP90 che di dCK diminuivano. Al contrario, sovraesprimendo HSP90, i livelli di dCK aumentavano.

Come faceva HSP90 a regolare dCK? Abbiamo scoperto che inibendo HSP90 (con 17-AAG o con shRNA), l’emivita della proteina dCK si riduceva drasticamente. Usando inibitori specifici (MG132 per il proteasoma e CQ per l’autofagia), abbiamo capito che HSP90 proteggeva dCK dalla degradazione tramite il sistema ubiquitina-proteasoma. In pratica, HSP90 impediva che dCK venisse “etichettata” per la distruzione.

Una Cascata di Regolazione: HSP90, WWP1/2, NEDD4L e dCK

Ma la storia è ancora più complessa e affascinante! Come fa HSP90 a impedire l’ubiquitinazione di dCK? Abbiamo cercato quale E3 ubiquitina-ligasi (l’enzima che attacca l’etichetta di ubiquitina) fosse responsabile della degradazione di dCK. Usando database predittivi (UbiBrowser), abbiamo identificato NEDD4L come un candidato promettente. E infatti, silenziando NEDD4L, i livelli di dCK aumentavano, e l’effetto inibitorio di 17-AAG su dCK veniva parzialmente annullato. Esperimenti di Co-IP hanno confermato che NEDD4L si lega a dCK e ne promuove l’ubiquitinazione (in particolare sul sito K34 di dCK).

Ma come entra in gioco HSP90 nel regolare NEDD4L? Sorprendentemente, abbiamo visto che sovraesprimere HSP90 riduceva l’emivita di NEDD4L! Sembrava controintuitivo: HSP90 protegge dCK ma accelera la degradazione di NEDD4L, che a sua volta degrada dCK. Come si spiega? Abbiamo cercato le E3 ligasi che potessero ubiquitinare NEDD4L stessa. Abbiamo identificato WWP1 e WWP2 (membri della stessa famiglia di NEDD4L). Sovraesprimendo WWP1/2, i livelli di NEDD4L diminuivano e, di conseguenza, i livelli di dCK aumentavano! Esperimenti di Co-IP hanno mostrato che WWP1/2 interagiscono con NEDD4L e, cosa cruciale, anche con HSP90. Esperimenti di co-localizzazione fluorescente hanno confermato che HSP90, WWP1, NEDD4L e dCK si trovano vicine nel citoplasma.

Quindi, abbiamo svelato un asse regolatorio complesso: HSP90 recluta WWP1/2, che ubiquitinano e degradano NEDD4L. Poiché NEDD4L non è più attiva, non può ubiquitinare dCK, che quindi rimane stabile. Un meccanismo elegante e finora sconosciuto!

L’Asse HSP90-WWP1/2-NEDD4L nel Controllo della Ferroptosi Indotta da Radiazioni

A questo punto, volevamo vedere se questo intero asse avesse un ruolo nella ferroptosi indotta da radiazioni. Abbiamo visto che sovraesprimere WWP1/2 nelle cellule con HSP90 knockdown (dove NEDD4L è stabile e dCK bassa) aumentava la morte cellulare e la perossidazione lipidica, specialmente dopo irradiazione. Questo ha senso: più WWP1/2 significa meno NEDD4L, quindi più dCK stabile, che protegge dalla ferroptosi. Al contrario, sovraesprimere NEDD4L annullava l’effetto protettivo di WWP1/2. Questo conferma che l’asse HSP90-WWP1/2-NEDD4L regola la sensibilità delle cellule HeLa alla ferroptosi indotta da radiazioni.

HSP90 come Bersaglio per Aumentare la Radiosensibilità

Abbiamo osservato che le radiazioni stesse aumentano l’espressione di HSP90 nelle cellule HeLa. Silenziando HSP90, le cellule diventavano più suscettibili alla morte indotta da radiazioni, e questa morte era principalmente ferroptosi (bloccabile da Fer-1). Il knockdown di HSP90 aumentava la radiosensibilità delle cellule, ma questo effetto poteva essere annullato sovraesprimendo dCK.

Per confermare l’importanza di HSP90 in vivo, abbiamo usato un modello animale (topi nude con tumori cervicali). Trattare i topi con l’inibitore di HSP90 17-AAG insieme alla radioterapia ha ridotto significativamente il volume e il peso dei tumori, senza effetti tossici evidenti sui topi. L’analisi dei tessuti tumorali ha confermato che 17-AAG agiva sull’asse HSP90-WWP1-NEDD4L-dCK come previsto. Questo suggerisce fortemente che 17-AAG possa agire come un farmaco radiosensibilizzante per il cancro cervicale.

Implicazioni Cliniche e Conclusioni

Analizzando nuovamente i dati clinici (TCGA, Kaplan-Meier), abbiamo confermato che alti livelli di HSP90AA1 sono associati a una sopravvivenza libera da recidiva (RFS) peggiore nelle pazienti con cancro cervicale. La prognosi peggiore in assoluto si osserva nelle pazienti con alti livelli sia di dCK che di HSP90. L’analisi delle curve ROC ha mostrato che la combinazione di questi marcatori (dCK + HSP90 + SLC7A11) ha un potere predittivo sulla sopravvivenza molto più alto rispetto ai singoli geni.

In sintesi, il nostro studio svela un meccanismo affascinante: in condizioni normali o dopo irradiazione, HSP90 stabilizza la proteina dCK inibendo la sua degradazione mediata da NEDD4L (attraverso il reclutamento di WWP1/2). La dCK stabile, a sua volta, potenzia l’espressione e la stabilità di SLC7A11 (tramite ESR1), rendendo le cellule HeLa resistenti alla ferroptosi indotta da radiazioni. Quando però combiniamo la radioterapia con un inibitore di HSP90 come 17-AAG, blocchiamo questo meccanismo protettivo: HSP90 viene inibita, NEDD4L diventa stabile, dCK viene degradata, SLC7A11 cala, e le cellule diventano sensibili alla ferroptosi, potenziando l’effetto antitumorale delle radiazioni.

Questi risultati aprono nuove strade: dCK potrebbe essere un nuovo bersaglio terapeutico per aumentare la radiosensibilità delle cellule tumorali cervicali, e gli inibitori di HSP90 potrebbero rappresentare una strategia preziosa per migliorare l’efficacia della radioterapia in queste pazienti. C’è ancora molta strada da fare, ma aver svelato questo complesso asse molecolare è un passo avanti fondamentale!

Fonte: Springer