Cromatografia Potenziata: Sveliamo i Segreti dei Farmaci con SDS e Spettroscopia!

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel mondo della chimica analitica, un posto dove precisione e innovazione si incontrano per risolvere problemi complessi. Avete mai pensato a come facciamo a separare e analizzare miscele complicate, come quelle presenti nei farmaci? Beh, una delle tecniche più potenti che abbiamo a disposizione è la cromatografia, in particolare la sua versione “ad alte prestazioni” su strato sottile, conosciuta come HPTLC (High-Performance Thin-Layer Chromatography). Ma cosa succede quando le cose si fanno davvero difficili? Ecco che entrano in gioco piccoli “trucchi” e tecnologie avanzate!

Nel mio lavoro, mi sono trovato di fronte alla sfida di analizzare un gruppo di farmaci utilizzati per disturbi neurodegenerativi: sulpiride, olanzapina, carbamazepina, trazodone, clomipramina e pridinolo. Separare una miscela così eterogenea non è una passeggiata. La HPTLC tradizionale, che usa lastrine ricoperte di gel di silice (la nostra “fase stazionaria”), a volte non basta. Serve qualcosa in più.

L’Idea Brillante: Modificare la Superficie con SDS

Qui entra in gioco il protagonista della nostra storia: il Sodio Dodecilsolfato, o più semplicemente SDS. Cos’è l’SDS? È un surfattante, una molecola un po’ speciale con una “testa” che ama l’acqua (idrofila) e una “coda” che la rifugge (idrofoba). Probabilmente lo conoscete perché è un ingrediente comune in shampoo e detergenti, ma in laboratorio ha usi molto più sofisticati!

L’idea è stata quella di aggiungere SDS alla fase mobile, cioè al solvente che fa “correre” i nostri farmaci sulla lastrina HPTLC (specificamente una lastrina RP-18 W, che è una versione modificata non polare del gel di silice). Perché? Perché l’SDS può interagire sia con la lastrina sia con i farmaci, cambiando le regole del gioco della separazione. In pratica, “riveste” la superficie della lastrina e interagisce con le molecole dei farmaci, modificando come e quanto velocemente si muovono.

Ma come facciamo a sapere cosa sta succedendo *davvero* a livello molecolare? Non possiamo certo vederlo a occhio nudo!

Spettroscopia Raman: I Nostri Occhi Molecolari

Ed ecco che chiamiamo in aiuto un’altra tecnologia potentissima: la spettroscopia Raman. Questa tecnica è come avere degli occhiali speciali che ci permettono di “vedere” le vibrazioni uniche delle molecole. È non invasiva, veloce e ci dà un sacco di informazioni sulla composizione chimica e sulla struttura di un campione.

Per la prima volta, abbiamo usato la spettroscopia Raman per studiare proprio questo sistema:

• Abbiamo “guardato” come diverse concentrazioni di SDS si attaccassero (adsorbissero) sulla superficie della nostra lastrina RP-18 W. Analizzando gli spettri Raman, abbiamo visto chiaramente dei segnali specifici dell’SDS comparire e intensificarsi all’aumentare della sua concentrazione. Questo ci ha confermato che l’SDS stava effettivamente ricoprendo la lastrina, come volevamo! La cosa interessante è che l’SDS non sembrava alterare chimicamente la lastrina stessa, ma solo “aggiungersi” ad essa, aumentando lo spessore dello strato attivo.
• Abbiamo anche usato la Raman per investigare i complessi che si formano tra l’SDS e uno dei farmaci, la carbamazepina. Anche qui, abbiamo osservato cambiamenti negli spettri Raman a seconda della concentrazione di SDS, dandoci indizi preziosi sulle interazioni in gioco. È stato affascinante vedere come l’intensità di alcuni segnali Raman del complesso carbamazepina-SDS fosse massima a una certa concentrazione di SDS (vicina a quella ottimale per la separazione) e poi diminuisse a concentrazioni più alte.

Trovare la Ricetta Perfetta: Ottimizzare la Separazione

Ovviamente, aggiungere SDS non basta. Bisogna trovare la quantità giusta! Abbiamo testato diverse concentrazioni di SDS nella fase mobile (che era una miscela di acetonitrile e un tampone acquoso a pH 6.73). I risultati sono stati illuminanti:

• Senza SDS, i farmaci si attaccavano troppo alla lastrina (forte ritenzione) e la separazione era scarsa.
• Aggiungendo un po’ di SDS, la ritenzione diminuiva (i farmaci si muovevano di più) e la separazione migliorava leggermente. Questo probabilmente a causa delle interazioni tra l’SDS (anionico) e la forma cationica della maggior parte dei nostri farmaci.
• Aumentando ancora l’SDS, la ritenzione continuava a diminuire e la selettività del sistema migliorava, portando alla separazione di quasi tutti i componenti della miscela. La concentrazione “magica” si è rivelata essere 18.75 mM di SDS.
• Oltre questa concentrazione, però, la selettività peggiorava di nuovo, e alcune coppie di farmaci tornavano a sovrapporsi.

Quindi, 18.75 mM di SDS era il nostro “sweet spot”! Abbiamo anche ottimizzato altri parametri, come il pH del tampone (6.71 è risultato il migliore) e la percentuale di acetonitrile (55% ha dato i risultati migliori).

Micelle Sì o Micelle No? La Questione della CMC

Una domanda cruciale era: a quella concentrazione ottimale di SDS, e con tutto quell’acetonitrile nella fase mobile, l’SDS forma delle micelle? Le micelle sono aggregati sferici che i surfattanti formano in soluzione sopra una certa concentrazione, detta Concentrazione Micellare Critica (CMC). La formazione di micelle cambia drasticamente le proprietà della soluzione e il meccanismo di separazione cromatografica.

Sappiamo che in acqua pura, la CMC dell’SDS è intorno a 8-8.5 mM. Ma la presenza di solventi organici come l’acetonitrile tende ad aumentarla. Per scoprirlo, abbiamo usato due tecniche diverse:

1. Spettrofotometria UV-Vis con Azorubina: Abbiamo aggiunto un colorante (azorubina) alle nostre soluzioni di SDS a varie concentrazioni e misurato come cambiava l’assorbimento della luce. Abbiamo notato un cambiamento significativo nel comportamento dell’assorbanza intorno ai 28 mM di SDS, indicando la formazione di micelle (o strutture simili).
2. Conduttometria: Abbiamo misurato la conducibilità elettrica delle soluzioni di SDS. La conducibilità aumenta linearmente con la concentrazione di SDS finché è in forma di singoli ioni. Quando iniziano a formarsi le micelle (che conducono meno efficacemente), la pendenza del grafico cambia. Anche qui, il punto di cambiamento era vicino ai 28 mM.

Quindi, la CMC nel nostro sistema era circa 28 mM. Questo significa che la nostra concentrazione ottimale per la separazione (18.75 mM) era sotto la CMC, in un regime che potremmo definire “alto submicellare” o forse di “micelle ibride” (micelle che incorporano anche molecole di acetonitrile). Questo ci dice molto sul meccanismo con cui avviene la separazione!

Risultati Concreti: Separazione Efficace e Analisi Quantitativa

Con la fase mobile ottimizzata (55% acetonitrile, tampone pH 6.71, 18.75 mM SDS), siamo riusciti a separare efficacemente la miscela dei sei farmaci sulla lastrina HPTLC. Cinque su sei erano separati alla base (baseline separation), il che è un ottimo risultato!

Ma non ci siamo fermati qui. Abbiamo valutato l’efficienza della separazione (l’altezza del piatto teorico, H, era molto buona, tra 39 e 73 µm) e la forma dei picchi cromatografici (i fattori di asimmetria As e di tailing Tf erano vicini a 1 per la maggior parte dei composti, indicando picchi belli “gaussiani”).

Infine, abbiamo validato il metodo per l’analisi quantitativa, cioè per determinare *quanto* farmaco c’è in un campione. Abbiamo verificato:

• Linearità: La risposta del detector era proporzionale alla quantità di farmaco in un certo intervallo di concentrazione.
• Limiti di Rivelabilità (LOD) e Quantificazione (LOQ): Abbiamo determinato le quantità minime di ciascun farmaco che potevamo rivelare e quantificare con precisione (valori nell’ordine dei microgrammi o frazioni di microgrammo per spot).
• Ripetibilità: Le misure erano consistenti se ripetute nello stesso giorno.

La prova del nove? Abbiamo applicato il metodo per analizzare il contenuto di questi farmaci in formulazioni farmaceutiche reali (compresse commerciali). I risultati sono stati molto buoni, con errori percentuali bassi rispetto al dichiarato in etichetta. Per l’olanzapina, abbiamo visto che usare uno standard interno migliorava ulteriormente la precisione. Confrontando i nostri range di concentrazione con altri metodi TLC pubblicati (per olanzapina e sulpiride), il nostro metodo si è dimostrato comparabile o addirittura migliore!

Un Approccio Integrato: La Forza della Sinergia

La cosa davvero potente di questo lavoro, secondo me, è stata l’integrazione di diverse tecniche: HPTLC, spettroscopia UV (usata per la detection sulla lastrina e per la CMC), spettroscopia Raman (per studiare le interazioni molecolari) e conduttometria (per la CMC). Ognuna di queste tecniche, usata da sola, dà informazioni utili, ma combinarle ci ha permesso di ottenere un quadro molto più completo e profondo di come funziona questo sistema di separazione.

La spettroscopia UV ci dice *cosa* c’è e *dove* si trova sulla lastrina, e ci aiuta a capire la formazione delle micelle. La conduttometria conferma la CMC. Ma è la spettroscopia Raman che ci fa “sbirciare” le interazioni a livello molecolare tra SDS, lastrina e farmaci. È questo approccio combinato che apre nuove strade per la ricerca futura e per lo sviluppo di metodi analitici sempre più potenti ed efficienti.

Inoltre, non dimentichiamo un aspetto importante: l’HPTLC con fasi mobili contenenti surfattanti come l’SDS può essere considerata una tecnica più “verde”, perché spesso permette di ridurre l’uso di solventi organici puri.

Insomma, combinando una tecnica cromatografica consolidata come l’HPTLC con un “ingrediente segreto” come l’SDS e strumenti di indagine avanzati come la spettroscopia Raman, siamo riusciti a sviluppare un metodo efficace per analizzare farmaci complessi, capendo anche meglio cosa succede dietro le quinte a livello molecolare. Un piccolo passo avanti nel grande mondo dell’analisi chimica!

Fonte: Springer