Glutammato e Zinco: La Danza Segreta nei Nostri Neuroni Svelata!

Ragazzi, lasciate che vi racconti una storia affascinante che arriva dritta dal cuore del nostro cervello, dai nostri neuroni. Parliamo di un attore fondamentale, lo zinco (Zn2+). È essenziale, pensate che circa il 10% delle proteine umane lo usa per funzionare o per mantenere la propria struttura. Ma come spesso accade in biologia, troppo stroppia: un suo squilibrio può portare a morte cellulare e malattie neurodegenerative.

Normalmente, le nostre cellule sono bravissime a tenere bassi i livelli di zinco nel citosol (la parte “liquida” della cellula) grazie a un sofisticato sistema di “buffer” e trasportatori. Ma la domanda che ci ronzava in testa era: quali stimoli *fisiologici*, normali, fanno aumentare questo zinco per regolare le attività neuronali? Non parliamo di danni o stress ossidativo, ma della normale comunicazione tra neuroni.

In passato, avevamo già scoperto che un altro neurotrasmettitore, la dopamina, poteva far salire i livelli di zinco attraverso una via che coinvolge cAMP e ossido nitrico (NO), attivando processi come l’autofagia e l’infiammazione. Questo ci ha messo la pulce nell’orecchio: e se anche altri neurotrasmettitori che attivano la produzione di NO potessero fare lo stesso?

Il Sospettato Numero Uno: Il Glutammato

Ed ecco che entra in scena il protagonista di oggi: il glutammato. È il neurotrasmettitore eccitatorio più comune nel nostro sistema nervoso, e sapevamo già che poteva attivare la produzione di NO. Poteva essere lui la chiave per un altro percorso di segnalazione dello zinco?

Per scoprirlo, abbiamo preso delle colture primarie di neuroni corticali embrionali di ratto (cellule nervose fresche fresche, diciamo) e le abbiamo “caricate” con un colorante fluorescente sensibile allo zinco, il FluoZin-3. Questo ci permette di “vedere” letteralmente dove e quando lo zinco aumenta dentro le cellule osservando i cambiamenti di luminosità al microscopio.

Ebbene, cosa abbiamo visto? Stimolando questi neuroni con il glutammato, la fluorescenza aumentava! Non subito, ma con un piccolo ritardo di circa 30 secondi, i livelli di zinco intracellulare ([Zn2+]i) iniziavano a salire gradualmente. Abbiamo anche visto che questo effetto dipendeva dalla dose di glutammato: più ne mettevamo (entro certi limiti), più lo zinco aumentava, con una concentrazione efficace media (EC50) di circa 7.9 µM, un valore compatibile con l’affinità dei recettori per il glutammato. Per essere sicuri che fosse proprio lo zinco, abbiamo provato a pre-trattare le cellule con TPEN, una molecola che “acchiappa” lo zinco: e infatti, l’aumento di fluorescenza indotto dal glutammato veniva bloccato. Bingo!

Abbiamo anche fatto un esperimento un po’ più “fisiologico”: abbiamo registrato l’attività elettrica di un singolo neurone (con la tecnica del patch-clamp) e contemporaneamente guardato i livelli di zinco nei neuroni vicini. Stimolando il primo neurone a scaricare potenziali d’azione (simulando la trasmissione di un segnale), abbiamo visto un chiaro aumento di zinco in alcuni neuroni vicini. Questo suggerisce che durante la normale neurotrasmissione, il glutammato rilasciato può far aumentare lo zinco nelle cellule postsinaptiche.

Quali Porte Apre il Glutammato? I Recettori Ionotropici

Ok, il glutammato fa aumentare lo zinco. Ma come? Il glutammato agisce legandosi a diversi tipi di recettori sulla superficie dei neuroni. Ci sono i recettori ionotropici (iGluR), che sono canali ionici che si aprono quando il glutammato si lega (come i recettori AMPA e NMDA), e i recettori metabotropici (mGluR), che attivano cascate di segnali interni.

Per capire quale tipo fosse coinvolto, abbiamo usato degli “apritori” (agonisti) e dei “bloccanti” (antagonisti) specifici per questi recettori.
I risultati sono stati chiari:

• Gli agonisti dei recettori ionotropici AMPA e NMDA facevano aumentare lo zinco, in modo simile al glutammato stesso.
• Gli agonisti dei recettori metabotropici (di gruppo I, II e III) non avevano effetti significativi sullo zinco.
• Bloccando i recettori AMPA (con DNQX) o NMDA (con AP5) prima di aggiungere il glutammato, l’aumento di zinco veniva fortemente ridotto. Bloccandoli entrambi, l’effetto era quasi annullato.

Quindi, la porta d’ingresso per questo effetto dello zinco sono proprio i recettori ionotropici del glutammato (iGluR), in particolare AMPA e NMDA.

La Cascata di Segnali: Calcio, CaM, CaMKII e NOS

Sappiamo che l’attivazione dei recettori NMDA fa entrare ioni calcio (Ca2+) nella cellula. E il calcio è un messaggero intracellulare potentissimo. Poteva essere lui l’innesco? E come si collegherebbe allo zinco? L’ipotesi era che l’aumento di calcio attivasse una serie di proteine in sequenza:
1. La Calmodulina (CaM): una proteina che lega il calcio.
2. La Chinasi II Calcio/Calmodulina-dipendente (CaMKII): un enzima attivato dal complesso Ca2+-CaM.
3. La Ossido Nitrico Sintasi (NOS): l’enzima che produce ossido nitrico (NO), e che sapevamo poter essere attivato da CaMKII.

Per testare questa cascata, abbiamo usato degli inibitori specifici per ogni passaggio:

• W7 (inibitore di CaM)
• KN62 (inibitore di CaMKII)
• Vinyl-L-NIO e L-NPA (inibitori della nNOS, la forma neuronale di NOS)

E i risultati hanno confermato l’ipotesi! Pre-trattando i neuroni con uno qualsiasi di questi inibitori, l’aumento di zinco indotto dal glutammato veniva significativamente ridotto. Questo ci dice che il glutammato, attraverso i recettori ionotropici, fa entrare calcio, che attiva CaM, che attiva CaMKII, che a sua volta attiva la NOS.

L’Ossido Nitrico: Il Messaggero che Libera lo Zinco

Ma allora, come entra in gioco lo zinco? L’ultimo passaggio della cascata è la produzione di ossido nitrico (NO) da parte della NOS. E qui torna utile una nostra scoperta precedente: l’NO può interagire con le metallotioneine (MTs), piccole proteine che legano avidamente lo zinco nel citosol, facendogliele rilasciare.

Abbiamo verificato se il glutammato aumentasse effettivamente la produzione di NO usando un altro colorante fluorescente, il DAF-FM, sensibile all’NO. E sì, il glutammato (e anche gli agonisti AMPA e NMDA) aumentava la fluorescenza del DAF-FM, indicando produzione di NO. Ancora più importante, gli inibitori di CaM (W7) e CaMKII (KN62) bloccavano anche questo aumento di NO. Invece, il chelante dello zinco (TPEN) non aveva effetto sulla produzione di NO, confermando che l’NO agisce *prima* dell’aumento di zinco.

Quindi, il quadro si completa: Glutammato -> iGluR -> Ingresso Ca2+ -> Attivazione CaM -> Attivazione CaMKII -> Attivazione NOS -> Produzione di NO -> Rilascio di Zn2+ dalle Metallotioneine -> Aumento di [Zn2+]i. Che catena affascinante!

Non Tutto il Calcio Viene per Nuocere (o per Liberare Zinco)

Uno potrebbe pensare: “Ma allora basta far entrare calcio in qualsiasi modo per far aumentare lo zinco?”. Abbiamo testato anche questo. Abbiamo usato una soluzione ad alto contenuto di potassio (High-K+) per depolarizzare la membrana dei neuroni e far aprire i canali del calcio voltaggio-dipendenti (VGCC), un altro modo per far entrare calcio.

L’High-K+ faceva effettivamente aumentare il calcio intracellulare, anche un po’ più del glutammato. Ma, sorpresa! L’aumento di NO e di zinco era minimo, quasi nullo rispetto a quello indotto dal glutammato. Questo è un punto cruciale: non basta un aumento *generale* di calcio. Sembra che sia importante *come* e *dove* il calcio entra. L’ingresso di calcio specificamente attraverso i recettori NMDA, che sono spesso localizzati vicino al complesso CaM-CaMKII-NOS nelle sinapsi, sembra essere molto più efficiente nell’attivare questa specifica cascata che porta all’aumento di zinco.

L’Interruttore Molecolare: La Fosforilazione di nNOS

Per avere una prova ancora più diretta dell’attivazione della NOS da parte di CaMKII indotta dal glutammato, siamo andati a vedere lo stato di “accensione” della NOS a livello molecolare. La NOS può essere modificata chimicamente tramite fosforilazione (l’aggiunta di un gruppo fosfato) in diversi punti, e questo ne regola l’attività. In particolare, la fosforilazione sul residuo Serina 1417 (Ser1417) la *attiva*, mentre quella su Serina 847 (Ser847) la *disattiva*.

Usando tecniche di Western Blot (che permettono di “vedere” proteine specifiche e il loro stato di fosforilazione), abbiamo scoperto che trattando i neuroni con glutammato, la fosforilazione su Ser1417 aumentava rapidamente (picco a 15 minuti) per poi tornare normale entro 30 minuti. La fosforilazione su Ser847, invece, non cambiava significativamente. L’High-K+, coerentemente con il fatto che non aumentava molto l’NO, non mostrava questo aumento precoce della fosforilazione attivatoria. Questo conferma che il glutammato, tramite la via CaMKII, “accende” transitoriamente la NOS fosforilandola nel punto giusto.

Lo Zinco Accende l’Infiammazione?

Ok, abbiamo scoperto questa nuova via di segnalazione glutammato-zinco. Ma a cosa serve? Che conseguenze ha per il neurone? Ricordate che avevamo visto un legame tra zinco e infiammazione nella via della dopamina? Abbiamo voluto verificare se fosse così anche per il glutammato.

Abbiamo cercato un marcatore dell’infiammazione chiamato NLRP3, che fa parte di un complesso proteico detto “inflammasoma”. Trattando i neuroni con glutammato per 30 minuti, abbiamo visto un aumento dei livelli di NLRP3. Ma la cosa interessante è che se prima del glutammato davamo il TPEN (il chelante dello zinco), questo aumento di NLRP3 veniva prevenuto!

Questo suggerisce che l’aumento di zinco indotto dal glutammato sia necessario per attivare almeno una parte della risposta infiammatoria nel neurone. È importante notare che in questi brevi tempi (15-30 minuti), il glutammato non causava una significativa morte cellulare (eccitotossicità), quindi l’infiammazione sembra essere una risposta specifica attivata dalla via dello zinco, e non solo una conseguenza di un danno generale.

Un Nuovo Capitolo nella Comunicazione Neuronale

Quindi, cosa ci portiamo a casa da questa ricerca? Abbiamo svelato una nuova via di segnalazione nei neuroni: il glutammato, oltre a eccitare elettricamente la cellula e far entrare calcio (segnale rapido), può innescare una cascata più lenta (CaM-CaMKII-NOS) che porta alla produzione di NO e al conseguente rilascio di zinco dalle sue riserve intracellulari (segnale ritardato).

Questo segnale di zinco, a sua volta, sembra coinvolto nell’attivazione di risposte come l’infiammazione. Perché questo ritardo? Potrebbe essere un modo per la cellula di rispondere in modo diverso a seconda dell’intensità e della durata della stimolazione glutammatergica. Una stimolazione breve e debole causa solo i segnali rapidi, mentre una stimolazione più robusta e prolungata attiva anche la via dello zinco, innescando risposte a più lungo termine.

Questa scoperta aggiunge un nuovo livello di complessità a come i neuroni comunicano e si adattano. Lo zinco non è solo un elemento strutturale o un cofattore, ma un vero e proprio secondo messaggero, orchestrato dal glutammato attraverso la danza molecolare di calcio, CaM, CaMKII e NO. Studiare questa via potrebbe aprire nuove prospettive per capire la plasticità sinaptica a lungo termine e forse anche per intervenire in condizioni patologiche dove questi equilibri sono alterati. Davvero affascinante, non trovate?

Fonte: Springer