Magnaporthe oryzae: Finalmente Abbiamo la Mappa Completa del Killer del Riso!

Amici scienziati e curiosi della natura, oggi vi porto nel mondo un po’ oscuro ma affascinantissimo della genomica, e vi racconto di come abbiamo messo sotto la lente d’ingrandimento uno dei nemici più temuti dell’agricoltura mondiale: il fungo Magnaporthe oryzae. Pensate, questo tipetto è la causa principale della “brusone”, una malattia che devasta le coltivazioni di riso e altri cereali, provocando perdite che potrebbero sfamare milioni di persone. Un vero disastro!

Il Vecchio Atlante Pieno di Buchi

Per combattere un nemico, bisogna conoscerlo a fondo, giusto? E quale modo migliore se non studiare il suo “manuale di istruzioni”, ovvero il suo genoma? Già nel 2005, avevamo ottenuto una prima versione del genoma del ceppo di riferimento, il 70-15, chiamata MG8. Un passo da gigante per l’epoca, pensate, è stato il primo fungo patogeno di piante ad avere il genoma sequenziato! Da allora, la versione MG8 è stata la nostra Bibbia per studiare questo fungo. Però, diciamocelo, quella mappa era un po’ come quelle dei pirati: preziosa, ma con un sacco di aree inesplorate, buchi (i cosiddetti “gap”) e regioni ripetitive che erano un vero rompicapo da decifrare con le tecnologie di allora, basate sul sequenziamento Sanger.

Negli anni, le tecnologie di sequenziamento hanno fatto passi da gigante. Immaginate di passare da una vecchia macchina fotografica a pellicola a uno smartphone di ultima generazione con una fotocamera pazzesca. Ecco, qualcosa del genere è successo nel mondo della genomica. Sono stati sequenziati i genomi di oltre 350 ceppi diversi di M. oryzae, alcuni raggiungendo addirittura una qualità “telomero-a-telomero” (T2T), cioè completi da un’estremità all’altra del cromosoma. Ma il nostro caro vecchio riferimento 70-15 era rimasto un po’ indietro, con la sua mappa datata.

Una Nuova Mappa Super Dettagliata: Arriva il T2T 70-15!

Era ora di dare una bella rinfrescata! Così, ci siamo messi al lavoro armati delle tecnologie più fiche del momento: il sequenziamento PacBio High-Fidelity (HiFi), che ci dà letture lunghe e super accurate, e i dati di cattura della conformazione della cromatina ad alta risoluzione (Hi-C), che ci aiutano a capire come i vari pezzi del genoma sono organizzati tridimensionalmente nello spazio, come se mettessimo insieme un puzzle 3D complicatissimo.

E che risultati, ragazzi! Abbiamo ottenuto un genoma nucleare completo da 44.82 Mb (milioni di paia di basi) e, non contenti, anche il genoma mitocondriale circolare completo da 35.95 kb (migliaia di paia di basi) per il ceppo 70-15. Pensate, il nuovo genoma è circa il 9% più grande della vecchia versione MG8. Questo significa che prima ci perdevamo un bel po’ di informazioni per strada!

La cosa più entusiasmante? Siamo riusciti a risolvere completamente, da telomero a telomero (T2T, come diciamo noi in gergo), ben cinque dei sette cromosomi (il 2, 3, 4, 6 e 7). Per gli altri due, abbiamo comunque identificato la sequenza di un telomero. I telomeri sono come i cappucci protettivi alle estremità dei lacci delle scarpe, ma per i cromosomi: fondamentali per la loro stabilità. Avere queste sequenze complete è un traguardo pazzesco!

Questo nuovo assemblaggio, che abbiamo battezzato T2T 70-15, è una vera e propria rivoluzione. Abbiamo potuto identificare e annotare molte più sequenze ripetitive, che ora costituiscono il 16.93% del genoma, un bel salto rispetto a prima. Queste regioni, spesso trascurate, sono importantissime per capire come il fungo si diversifica geneticamente e come controlla l’espressione dei suoi geni, specialmente quelli che codificano per gli “effettori”.

Geni, Effettori e Altre Meraviglie Nascoste

A proposito di geni! Grazie a questa mappa super dettagliata e all’analisi di dati di espressione genica (RNA sequencing) ottenuti in diverse condizioni di crescita, abbiamo predetto ben 12.100 geni codificanti per proteine nel genoma nucleare. Anche il genoma mitocondriale è stato scandagliato, rivelando geni per le subunità ribosomiali e 27 geni tRNA.

Ma la parte forse più “piccante” per chi studia le malattie delle piante è l’identificazione degli effettori. Gli effettori sono delle proteine speciali che il fungo secerne per manipolare la pianta ospite e facilitare l’infezione. Sono un po’ come le chiavi false o gli strumenti di scasso di un ladro esperto. Utilizzando metodi di predizione basati su domini proteici e machine learning, abbiamo identificato 493 effettori ad alta confidenza. Conoscere questo arsenale è cruciale per sviluppare strategie di difesa per le piante.

Per ottenere tutto questo, abbiamo seguito un protocollo meticoloso. Abbiamo coltivato il fungo, isolato il suo DNA con cura certosina, preparato le librerie per il sequenziamento PacBio e Illumina, e poi via con l’analisi bioinformatica! Un flusso di lavoro complesso che ha coinvolto diversi software e passaggi di “pulizia” e “correzione” dell’assemblaggio, fino a chiudere manualmente gli ultimi buchi rimasti. Un lavoro di pazienza e precisione, ve lo assicuro!

Qualità da Medaglia d’Oro

Ma come facciamo a dire che questo nuovo genoma è davvero “buono”? Usiamo degli indicatori di qualità. Ad esempio, il punteggio BUSCO, che verifica la presenza di geni che dovrebbero esserci in funghi simili, è del 97.6% per i geni completi a singola copia. Ottimo! L’indice di assemblaggio delle LTR (LAI), che misura quanto bene sono assemblate certe sequenze ripetute chiamate retrotrasposoni a lunga terminazione ripetuta, è di 32.8. Un valore sopra 20 è considerato “golden reference”, quindi siamo messi benissimo!

Abbiamo anche confrontato il nostro assemblaggio con quello vecchio (MG8) e con i genomi di altri ceppi di M. oryzae. Le analisi di colinearità mostrano una buona corrispondenza, ma il nostro T2T 70-15 corregge anche potenziali errori di assemblaggio presenti nella versione precedente. Insomma, abbiamo fatto un bel passo avanti in termini di continuità e accuratezza.

Ad esempio, abbiamo identificato 22 tra traslocazioni e inversioni tra i due genomi. Andando a vedere nel dettaglio, ben 20 di queste regioni nel nostro nuovo assemblaggio sono supportate da una copertura eccellente delle letture HiFi, confermando la loro correttezza. Al contrario, 13 delle 22 regioni problematiche nel vecchio genoma MG8 avevano dei “gap” nelle vicinanze, suggerendo che fossero proprio questi buchi a causare errori.

Perché Tutto Questo Lavoro?

Vi chiederete: “Ok, bello, ma a che serve?”. Serve, eccome! Avere un genoma di riferimento di così alta qualità per Magnaporthe oryzae è come avere una mappa stradale ultra-dettagliata per esplorare una città sconosciuta. Ci permette di:

• Capire meglio la biologia del fungo: come cresce, come si riproduce, come infetta le piante.
• Fare genomica comparativa: confrontare il suo genoma con quello di altri ceppi o specie per capire cosa lo rende così aggressivo o specifico per certe piante.
• Studiare la genetica di popolazione: come si evolve il fungo nel tempo e nello spazio, e come sviluppa resistenza ai fungicidi.
• Identificare nuovi bersagli per fungicidi o geni di resistenza nelle piante.

In pratica, questo nuovo genoma T2T 70-15 è una risorsa preziosissima che darà una bella spinta alla ricerca su questo patogeno così importante dal punto di vista economico e per la sicurezza alimentare globale. È un po’ come aver affilato le nostre armi nella lotta contro la brusone del riso. E credetemi, ogni piccolo passo avanti in questo campo può fare una grande differenza per milioni di persone nel mondo.

Il nostro lavoro non finisce qui, ovviamente. Questa mappa è solo l’inizio di nuove esplorazioni. Ma per oggi, possiamo dire di aver aggiunto un tassello fondamentale alla nostra conoscenza di questo formidabile avversario. E chissà, magari la prossima volta vi racconterò di come abbiamo usato questa mappa per sconfiggerlo!

Fonte: Springer