Cuore, Geni e AI: Svelando i Segreti della Cardiomiopatia Ipertrofica con il Machine Learning

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel mondo della ricerca cardiaca, dove la tecnologia più avanzata incontra la biologia per svelare i misteri di una malattia complessa: la cardiomiopatia ipertrofica (HCM). Immaginate il cuore, il nostro motore instancabile. A volte, per ragioni non sempre chiare, il muscolo cardiaco, specialmente nel ventricolo sinistro, inizia a ispessirsi in modo anomalo. Questa è l’HCM, una condizione che può portare a conseguenze serie come insufficienza cardiaca, aritmie pericolose e persino morte improvvisa.

Per anni, noi ricercatori abbiamo cercato di capire cosa scatena questo ispessimento patologico. Sappiamo che è diverso dall’ipertrofia “buona” che avviene, ad esempio, con l’esercizio fisico. Nell’HCM patologica, le cellule muscolari cardiache (i cardiomiociti) si ingrandiscono, ma la rete di capillari che porta ossigeno e nutrienti non tiene il passo. Si crea uno squilibrio energetico, un po’ come chiedere a un motore potenziato di funzionare con poco carburante. E indovinate quali sono le centraline energetiche delle nostre cellule? Esatto, i mitocondri!

Il Sospetto: I Mitocondri C’entrano Qualcosa?

Diversi indizi puntavano verso i mitocondri. Mutazioni nel DNA mitocondriale sono state associate all’HCM, e studi al microscopio elettronico hanno mostrato alterazioni nella struttura e nella funzione dei mitocondri nei cuori affetti da questa patologia. Sembrava chiaro che il metabolismo energetico, e in particolare la salute dei mitocondri, fosse un tassello cruciale del puzzle. Ma come identificare i geni specifici coinvolti in questa disfunzione mitocondriale nell’HCM? Qui entra in gioco la potenza della bioinformatica e del machine learning.

A Caccia di Geni: Dati, Reti e Algoritmi

Il nostro punto di partenza è stato un enorme set di dati, il Gene Expression Omnibus (GEO), che contiene informazioni sull’espressione genica di centinaia di persone, alcune con HCM e altre sane (il nostro gruppo di controllo). Abbiamo usato potenti strumenti software (come il pacchetto R “limma”) per confrontare questi profili e identificare i geni che si comportavano diversamente nei pazienti con HCM. Ne abbiamo trovati migliaia! Per la precisione, 7975 geni “differenzialmente espressi” (DEGs), alcuni più attivi, altri meno attivi nei cuori malati.

Ma avere una lista così lunga è come avere un elenco telefonico senza sapere chi chiamare. Avevamo bisogno di capire quali di questi geni fossero davvero importanti e come interagissero tra loro. Qui è entrata in scena un’altra tecnica potentissima: l’analisi delle reti di co-espressione genica ponderata (WGCNA). Immaginatela come un social network per geni: WGCNA ci aiuta a identificare gruppi di geni (chiamati “moduli”) che tendono a lavorare insieme, attivandosi o disattivandosi in modo coordinato.

Analizzando i nostri DEGs con WGCNA, abbiamo identificato 14 moduli. Uno in particolare, che abbiamo chiamato “modulo blu”, ha catturato la nostra attenzione. Conteneva 236 geni e mostrava una forte correlazione negativa con l’HCM (cioè, i geni in questo modulo erano tendenzialmente meno attivi nei pazienti) e positiva con il gruppo di controllo. Sembrava proprio che questo modulo nascondesse informazioni preziose!

Decodificare il Modulo Blu: Funzioni Biologiche e Piste Immunitarie

Per capire cosa facessero i geni del modulo blu, abbiamo eseguito analisi di arricchimento funzionale (GO, KEGG, GSEA). È come chiedere a Google cosa fanno questi geni. I risultati sono stati illuminanti! Molti geni erano coinvolti in processi legati a:

• Organizzazione del citoscheletro (l’impalcatura delle cellule)
• Funzioni mitocondriali e metabolismo energetico
• Processi infiammatori e risposte immunitarie (adesione leucocitaria, attivazione dei mieloidi, risposta ai batteri)
• Apoptosi (morte cellulare programmata)

La connessione con l’immunità era particolarmente intrigante. Il cuore non è solo muscolo; contiene anche cellule immunitarie, fibroblasti e cellule endoteliali. Studi recenti suggeriscono che l’infiammazione e il sistema immunitario giochino un ruolo importante nel rimodellamento cardiaco che avviene nell’HCM.

Spinti da questi risultati, abbiamo deciso di indagare più a fondo l’infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto cardiaco dei pazienti con HCM, usando una batteria di strumenti bioinformatici (xCell, ESTIMATE, EPIC, MCP-counter, CIBERSORT, ssGSEA). Abbiamo scoperto differenze significative rispetto ai controlli sani. Ad esempio, nei pazienti HCM c’era una minore abbondanza di monociti, cellule dendritiche, neutrofili e alcune cellule T, mentre altre popolazioni come i macrofagi M2 sembravano aumentate. Questo quadro suggeriva un’alterazione complessa del microambiente immunitario nel cuore ipertrofico.

Machine Learning al Lavoro: Trovare l’Ago nel Pagliaio

Avevamo il nostro modulo blu, ricco di geni interessanti legati a mitocondri e immunità. Ma quale gene era il vero protagonista? Per rispondere a questa domanda, ci siamo affidati al machine learning (ML). Abbiamo utilizzato ben sei diversi algoritmi di ML:

• LASSO Regression
• Random Forest (RF)
• Support Vector Machine – Recursive Feature Elimination (SVM-RFE)
• Decision Tree
• XGBoost
• LightGBM

Ognuno di questi algoritmi “impara” dai dati a riconoscere i pattern associati all’HCM e a identificare i geni più predittivi, quelli che meglio distinguono i cuori malati da quelli sani. È stato come mettere al lavoro sei detective diversi, ognuno con il suo metodo, per trovare il colpevole.

Ma non ci siamo fermati qui. Abbiamo aggiunto un altro livello di analisi: le interazioni proteina-proteina (PPI). I geni producono proteine, e le proteine spesso lavorano insieme interagendo fisicamente. Abbiamo usato database come STRING e software come Cytoscape (con i plugin Cytohubba e MCODE) per costruire una rete di queste interazioni all’interno del modulo blu e identificare le proteine (e quindi i geni) più centrali, quelle con più connessioni.

Il Momento “Eureka!”: Identificato il Gene Chiave, CEBPD

E ora, il momento clou! Abbiamo preso i risultati di tutti e sei gli algoritmi di machine learning, i risultati delle analisi PPI (Cytohubba e MCODE) e li abbiamo incrociati con una lista di geni noti per essere associati alla disfunzione mitocondriale (ottenuta dal database GeneCards). Volevamo trovare il gene che fosse al centro di tutto: importante per il machine learning, centrale nelle reti proteiche e legato ai mitocondri.

L’incrocio di tutte queste informazioni ha fatto emergere un nome: CEBPD (CCAAT/Enhancer Binding Protein Delta). Questo gene è emerso come il nostro “Most Characteristic Gene” (MCG), il candidato più promettente. CEBPD è un fattore di trascrizione, cioè una proteina che regola l’attività di altri geni, ed è noto per essere coinvolto nelle risposte infiammatorie e immunitarie. Ma studi recenti lo collegano anche alla funzione mitocondriale e al metabolismo energetico. Bingo! Sembrava proprio il collegamento mancante tra infiammazione, metabolismo e HCM.

La Prova del Nove: Validazione in Laboratorio

Identificare un gene candidato con metodi computazionali è entusiasmante, ma la vera prova è la validazione sperimentale. Dovevamo confermare che CEBPD fosse davvero meno attivo nei cuori con HCM.
Prima di tutto, abbiamo usato altri set di dati pubblici (GSE1145 e GSE32453) come “validation ladder” e abbiamo confermato che l’espressione di CEBPD era significativamente più bassa nei pazienti HCM anche in questi dati indipendenti. Le curve ROC, che misurano la capacità diagnostica di un marcatore, hanno mostrato che CEBPD era un buon discriminatore tra HCM e controlli.

Poi siamo passati al laboratorio. Abbiamo creato modelli animali di HCM inducendo un restringimento dell’aorta (chiamato TAC, Transverse Aortic Constriction) in topi C57BL/6. Dopo 28 giorni, questi topi sviluppavano i segni tipici dell’HCM: cuore ingrossato, pareti ventricolari ispessite, fibrosi (cicatrici nel tessuto) e ridotta funzione contrattile (misurata con l’ecocardiografia come LVEF e LVFS). Abbiamo anche osservato un aumento dei marcatori classici di ipertrofia come ANP e β-MHC.

In parallelo, abbiamo creato un modello cellulare trattando cardiomiociti primari isolati da topi neonati con angiotensina II, una sostanza nota per indurre ipertrofia. Anche in questo caso, abbiamo osservato un aumento di ANP e β-MHC.

E CEBPD? Sia nel modello animale (tessuto cardiaco dei topi TAC) che nel modello cellulare (cardiomiociti trattati con angiotensina II), abbiamo misurato i livelli di mRNA e proteina di CEBPD. I risultati hanno confermato le nostre previsioni: l’espressione di CEBPD era significativamente ridotta in entrambi i modelli di HCM rispetto ai controlli. Abbiamo anche notato un aumento dell’apoptosi (morte cellulare) nei cuori dei topi TAC, un altro processo in cui i geni del modulo blu sembravano coinvolti.

Dalla Scoperta alla Terapia: Alla Ricerca di Farmaci Mirati

Identificare un gene chiave come CEBPD apre la porta a nuove strategie terapeutiche. Potremmo trovare un farmaco che moduli l’attività di CEBPD o i percorsi da esso regolati? Per esplorare questa possibilità, abbiamo usato un altro strumento bioinformatico fantastico: ConnectivityMap (Cmap). Cmap è un database che collega le firme di espressione genica (come quelle che abbiamo osservato nel modulo blu) a migliaia di piccole molecole (farmaci o composti chimici). In pratica, abbiamo chiesto a Cmap: “Quali farmaci inducono cambiamenti genetici opposti a quelli che vediamo nell’HCM nel modulo blu?”.

Cmap ci ha restituito una lista di candidati promettenti. Tra i primi 10 composti con il punteggio di connettività migliore c’erano molecole come Resiquimod, Tazarotene, Rimexolone e… Abt-751.

Per capire come questi potenziali farmaci potessero interagire con la nostra proteina target CEBPD, abbiamo eseguito simulazioni di molecular docking. È come provare virtualmente diverse chiavi (i farmaci) in una serratura (la proteina CEBPD) per vedere quale si adatta meglio. Abbiamo scaricato le strutture 3D dei 10 farmaci candidati e della proteina CEBPD e abbiamo usato software come AutoDock e PyMOL per simulare il loro legame.

Il risultato? Tutti e 10 i composti mostravano una certa affinità per CEBPD, ma uno spiccava sugli altri: Abt-751 ha mostrato la più alta affinità di legame. Abt-751 è noto per inibire la polimerizzazione della tubulina, un processo coinvolto anche nel traffico mitocondriale. Questo lo rende un candidato particolarmente intrigante per futuri studi come potenziale farmaco mirato per l’HCM.

Cosa Abbiamo Imparato e Dove Andiamo Ora

Questo studio è stato un esempio incredibile di come l’integrazione di diverse tecnologie – analisi trascrittomica, WGCNA, machine learning, analisi di reti proteiche, validazione sperimentale *in vivo* e *in vitro*, e drug prediction/docking – possa portare a scoperte significative.

Abbiamo identificato CEBPD come un nuovo potenziale attore chiave nella cardiomiopatia ipertrofica, probabilmente agendo all’intersezione tra disfunzione mitocondriale e disregolazione immunitaria. La sua ridotta espressione nei modelli di HCM suggerisce che possa avere un ruolo protettivo che viene perso nella malattia.

Abbiamo anche evidenziato l’importanza del microambiente immunitario nell’HCM, mostrando alterazioni specifiche nell’infiltrazione di cellule come monociti e cellule T.

Infine, abbiamo identificato Abt-751 come un potenziale farmaco mirato che lega fortemente CEBPD, aprendo una nuova possibile via terapeutica.

Certo, la strada è ancora lunga. Questi risultati dovranno essere confermati in studi più ampi, possibilmente su campioni umani. I modelli animali e cellulari, sebbene utili, non replicano perfettamente la complessità della malattia nell’uomo. L’efficacia e la sicurezza di Abt-751 dovranno essere testate rigorosamente *in vivo*. Inoltre, i meccanismi molecolari precisi con cui CEBPD influisce sulla funzione mitocondriale e sull’immunità nel cuore richiedono ulteriori indagini.

Tuttavia, credo che questo lavoro offra una nuova, eccitante prospettiva sulla comprensione e sul trattamento dell’HCM. Identificare target molecolari specifici come CEBPD è fondamentale per sviluppare terapie più mirate ed efficaci in futuro. È un passo avanti nella lotta contro questa malattia cardiaca debilitante. Spero che questo viaggio nella nostra ricerca vi sia piaciuto!

Fonte: Springer