Zanzare Modificate Geneticamente: La Mia Scommessa Contro la Malaria con il Gene Drive miR-184

Parliamoci chiaro, la lotta contro la malaria sembra essersi impantanata. Negli ultimi anni, nonostante vaccini e zanzariere trattate, i casi globali non scendono come speravamo, anzi, nel 2022 eravamo ancora a 249 milioni! E come se non bastasse, ci si mettono pure le resistenze agli insetticidi, ai farmaci, e persino nuove zanzare vettore che si adattano alle città. Insomma, c’è un bisogno disperato di nuove armi, di strategie innovative se vogliamo davvero pensare di eliminare questa piaga.

Ed è qui che entro in gioco io, o meglio, la tecnologia su cui sto lavorando con passione: il gene drive basato su CRISPR. Immaginate di poter “truccare” le regole dell’ereditarietà genetica nelle zanzare per diffondere rapidamente un tratto desiderato in tutta la popolazione selvatica. L’idea non è nuova, circola da vent’anni, ma con CRISPR abbiamo gli strumenti per renderla concreta e flessibile.

Due Strategie Principali: Soppressione vs Modifica

Finora, ci siamo mossi principalmente su due fronti:

• Gene drive di soppressione: L’obiettivo è ridurre drasticamente il numero di zanzare, colpendo geni essenziali per la loro sopravvivenza o fertilità (ad esempio, rendendo sterili le femmine o sbilanciando il rapporto tra i sessi a favore dei maschi).
• Gene drive di modifica: Qui non puntiamo a eliminare le zanzare, ma a renderle incapaci di trasmettere la malaria. Come? Diffondendo geni “effettori” che bloccano lo sviluppo del parassita *Plasmodium* all’interno della zanzara stessa.

Entrambe le strategie hanno pro e contro. La soppressione mira all’eliminazione del vettore, ma solleva preoccupazioni ambientali (nicchie ecologiche vuote?) e rischia di selezionare resistenze nel tempo. La modifica è forse più “soft” ecologicamente e logisticamente, ma non riduce il fastidio delle punture e potrebbe vedere emergere parassiti resistenti all’effetto anti-malarico.

E Se Unissimo le Forze? L’Idea del Gene Drive “Soppressione-Modifica”

Mi sono chiesto: e se potessimo combinare il meglio dei due mondi? Un gene drive che riduca moderatamente la fitness delle zanzare, permettendogli comunque di diffondersi e fissarsi nella popolazione, ma portando con sé anche un carico anti-malarico? Un approccio sinergico, insomma.

La sfida era trovare il bersaglio giusto: un gene super conservato (per evitare resistenze facili) ma la cui alterazione non fosse letale o sterilizzante (altrimenti il drive non si diffonde). Sembra una contraddizione, vero? Eppure, una classe di geni sembrava fare al caso nostro: i microRNA (miRNA). Sono piccoli geni RNA che regolano l’espressione di molti altri geni. Spesso sono incredibilmente conservati tra specie diverse, ma la loro funzione può variare. Alterarli potrebbe avere effetti sulla fitness delle zanzare, ma raramente causa sterilità o morte totale, almeno stando agli studi su altri insetti come la Drosophila.

Il Bersaglio Scelto: miR-184, un miRNA Ultra-Conservato

La mia attenzione si è concentrata su aga-miR-184 (AGAP028779 nel genoma di *Anopheles gambiae*). Perché proprio lui?

• È uno dei miRNA più espressi nelle zanzare, specialmente nell’intestino medio (un tessuto chiave per l’interazione col parassita della malaria).
• È risultato tra i geni più ultra-conservati in uno screening su 21 specie di zanzare.
• Nonostante la sua conservazione, la sua funzione esatta non è chiarissima, ma studi su altri organismi suggerivano ruoli nell’immunità, nello sviluppo, o nella risposta allo stress – tutti aspetti potenzialmente interessanti per il controllo dei vettori.

L’idea era: colpiamo miR-184 con un gene drive CRISPR. Vediamo cosa succede.

Costruzione e Primi Risultati: Il Gene Drive miR-184D

Abbiamo quindi costruito il nostro gene drive, che chiameremo miR-184D. Contiene l’enzima Cas9 (le “forbici molecolari”) sotto il controllo di un promotore specifico delle cellule germinali (zpg), e un gRNA che guida Cas9 a tagliare proprio dentro la sequenza matura e conservata di miR-184. Abbiamo inserito anche un marcatore fluorescente (GFP) per seguire facilmente il drive.

Siamo riusciti a creare la linea transgenica miR-184D in *Anopheles gambiae*. E le prime sorprese non sono mancate:

• Efficienza di trasmissione altissima: Quando incrociavamo zanzare con una copia del drive (emizigoti D+) con zanzare normali (++), la prole ereditava il drive nel 99.6% dei casi dalle madri e nel 97.1% dai padri. Praticamente perfetto! Questo significa che il drive si “copia” sull’altro cromosoma quasi sempre.
• Espressione inattesa di GFP: Abbiamo notato che il marcatore GFP si esprimeva fortemente nell’intestino medio degli adulti e delle larve, anche se il promotore usato (3xP3) è tipicamente neuronale. Probabilmente, elementi regolatori vicini al gene miR-184 stavano influenzando l’espressione del nostro costrutto.
• miR-184 quasi azzerato: Come previsto, nelle zanzare con due copie del drive (omozigoti DD), il livello del miRNA maturo miR-184 era praticamente indetectable.

Gli Effetti sulla Fitness: Un Quadro Complesso

Ok, il drive funziona e colpisce il bersaglio. Ma che effetto ha sulla zanzara? Qui le cose si fanno interessanti e un po’ inaspettate.

• Fertilità e Fecondità Intatte: Contrariamente a quanto visto in Drosophila, non abbiamo trovato effetti significativi sulla capacità di deporre uova o sulla schiusa delle larve. Le femmine DD erano perfettamente fertili. Questo è un punto cruciale: possiamo allevare linee pure DD in laboratorio per eventuali rilasci!
• Problemi di Volo: Una parte significativa (fino al 40%) degli adulti omozigoti DD mostrava difficoltà a iniziare o sostenere il volo. Anche tra quelli che volavano, test specifici hanno suggerito una ridotta capacità di volo nelle femmine DD.
• Vita Più Breve: La durata della vita degli adulti DD nutriti solo con zucchero era significativamente ridotta rispetto alle zanzare normali (mediana di 20-25 giorni contro 32-35). Anche gli emizigoti D+ vivevano un po’ meno.
• Mortalità Post-Pasto di Sangue: Questa è stata la scoperta più sorprendente. Quando le femmine DD facevano un pasto di sangue (necessario per la maturazione delle uova e la trasmissione della malaria), mostravano una mortalità altissima nei giorni successivi! Questo succedeva con diversi tipi di sangue e sembrava legato allo stress metabolico del pasto stesso, non tanto a un’incapacità di gestire lo stress ossidativo (abbiamo testato anche quello). Curiosamente, lasciare a disposizione acqua e zucchero dopo il pasto di sangue riduceva un po’ questa mortalità immediata, suggerendo un legame con lo stato nutrizionale.
• Nessun Effetto Diretto sul Parassita: Nonostante l’alta espressione di miR-184 nell’intestino, le femmine DD infettate con *Plasmodium berghei* o *Plasmodium falciparum* non mostravano differenze significative nel carico di parassiti rispetto alle normali. L’effetto anti-malarico di questo drive, quindi, non è diretto sul parassita, ma indiretto, attraverso la riduzione della fitness e della longevità della zanzara.

Abbiamo anche creato una versione del drive senza GFP (miR-184d) per assicurarci che i problemi di volo e la ridotta longevità non fossero dovuti all’espressione del marcatore. E infatti, questi fenotipi erano legati proprio alla perdita di miR-184.

Cosa Succede nell’Intestino? La Pista del Trasporto di Soluti

Per capire meglio la causa della mortalità post-pasto di sangue e gli altri effetti, abbiamo analizzato quali geni venivano espressi in modo diverso nell’intestino e nel resto del corpo delle femmine DD rispetto alle normali.
I risultati dell’analisi trascrittomica sono stati illuminanti: nell’intestino delle zanzare DD c’era un gran subbuglio nell’espressione di geni legati al trasporto di soluti (aminoacidi, zuccheri, vitamine, acqua, ioni). Molti trasportatori erano sovra-espressi. Addirittura, geni normalmente tipici dei Tubuli Malpighiani (l’equivalente dei nostri reni) risultavano più espressi nell’intestino delle DD.
Abbiamo anche cercato potenziali geni bersaglio diretti di miR-184 tra quelli sovra-espressi. Ne abbiamo trovati alcuni, e tra questi spiccavano geni coinvolti nella formazione delle giunzioni settate, strutture cruciali per mantenere l’integrità e la permeabilità dei tessuti epiteliali, come quello dell’intestino. Questo si allinea con studi precedenti in Drosophila.

L’ipotesi che sta emergendo è che miR-184 giochi un ruolo nel regolare la permeabilità e il trasporto nell’intestino e forse negli organi escretori. Senza miR-184, questo equilibrio salta, e lo stress metabolico enorme causato da un pasto di sangue diventa insostenibile per la zanzara.

Il Drive alla Prova delle Gabbie: Invasione e Riduzione della Fitness

Ok, abbiamo un drive efficiente che causa costi di fitness interessanti, soprattutto in omozigosi, ma che permette la riproduzione. È ora di vedere come si comporta in una popolazione. Abbiamo allestito esperimenti in gabbia, simulando un rilascio.
In alcune gabbie abbiamo introdotto zanzare DD in una popolazione di zanzare normali (frequenza iniziale del drive del 20%). In altre gabbie, oltre al drive miR-184D, abbiamo introdotto anche un altro costrutto transgenico, chiamato MM-CP. Questo MM-CP esprime peptidi anti-malarici e può diffondersi solo se “aiutato” dal Cas9 fornito dal nostro drive miR-184D (è un drive non autonomo).

I risultati sono stati entusiasmanti:

• Invasione e Fissazione: Nonostante un calo iniziale dovuto alla minore fitness degli omozigoti, il drive miR-184D ha iniziato a diffondersi e ha raggiunto la fissazione (cioè era presente in tutte le zanzare) in tutte le gabbie intorno alla 14ª generazione.
• Riduzione della Fitness Popolazionale: Man mano che il drive si diffondeva, abbiamo osservato una tendenza generale alla diminuzione della produzione di uova nelle gabbie, un indicatore della ridotta fitness complessiva della popolazione.
• Propagazione dell’Effettore Anti-Malarico: Nelle gabbie dove era presente, il drive miR-184D è stato efficacissimo nel trascinare con sé e far diffondere anche il costrutto anti-malarico MM-CP, che ha raggiunto anch’esso la fissazione.
• Resistenza? Dopo 21 generazioni, abbiamo analizzato nel dettaglio gli alleli presenti. Non abbiamo trovato alleli normali (wild-type) né per miR-184 né per il sito di inserzione di MM-CP. Abbiamo trovato alcune varianti dell’allele miR-184 (piccole delezioni) a bassa frequenza in un paio di gabbie, ma il drive era comunque dominante. Questo suggerisce che, almeno in gabbia, la resistenza funzionale non è stata un ostacolo insormontabile, anche se andrà monitorata attentamente in scenari più complessi.

Questo esperimento ha dimostrato che un drive come miR-184D, pur avendo costi di fitness, può invadere e fissarsi in una popolazione, riducendone la produttività e contemporaneamente diffondendo un carico utile anti-malarico. Una dinamica così non era mai stata descritta prima.

Simulazioni al Computer: L’Impatto Potenziale sul Campo

Ma come si tradurrebbe tutto questo nella realtà, sul campo, dove le condizioni sono molto più variabili? Per farci un’idea, abbiamo usato un sofisticato modello matematico chiamato EMOD, che simula la trasmissione della malaria includendo la dinamica delle zanzare, del parassita e degli esseri umani.
Abbiamo simulato il rilascio del nostro drive miR-184D, variando diversi parametri: l’efficienza del drive, la probabilità che si formino alleli resistenti funzionali, l’entità della riduzione della durata della vita e della mortalità post-pasto di sangue. Abbiamo testato diversi scenari di intensità di trasmissione della malaria.

I risultati delle simulazioni sono molto incoraggianti:

• Anche livelli moderati di mortalità giornaliera e mortalità post-pasto di sangue (come quelli che osserviamo) sono estremamente efficaci nel ridurre la trasmissione della malaria. Questo perché colpiscono selettivamente le zanzare femmine più anziane, quelle che hanno avuto il tempo di infettarsi e diventare infettanti.
• Questo impatto mirato sulla longevità è risultato spesso più efficace, nelle simulazioni, di una mortalità altissima (che potrebbe portare all’eradicazione locale della popolazione di zanzare ma anche selezionare più fortemente per la resistenza), specialmente quando si considera la possibile comparsa di resistenza funzionale.
• In molti scenari simulati, il rilascio del drive miR-184D era in grado di portare all’eliminazione locale della malaria o a riduzioni molto forti dei casi clinici nei 5 anni successivi al rilascio.

Conclusioni (Provvisorie) e Prospettive Future

Quello che abbiamo sviluppato con miR-184D è, a mio avviso, un candidato molto promettente. È un gene drive che integra aspetti della soppressione e della modifica: riduce la fitness generale della popolazione (meno uova, vita più breve, problemi post-pasto di sangue) e, cosa fondamentale, riduce drasticamente la capacità delle singole zanzare di vivere abbastanza a lungo da trasmettere la malaria. Inoltre, abbiamo dimostrato che può diffondere efficacemente anche un effettore anti-malarico separato.

Un vantaggio non da poco è che possiamo allevare linee omozigoti pure in laboratorio, semplificando la produzione per eventuali rilasci. Il bersaglio, miR-184, essendo un RNA ultra-conservato, potrebbe offrire una maggiore robustezza contro l’evoluzione della resistenza funzionale, anche se questo andrà verificato su larga scala. Le simulazioni suggeriscono che anche se l’impatto sulla fitness fosse meno severo sul campo rispetto al laboratorio, l’effetto sulla trasmissione della malaria sarebbe comunque significativo.

Certo, la strada è ancora lunga. Nessun gene drive è mai stato testato in ambiente aperto. Serviranno studi più approfonditi per capire tutti gli effetti sulla fitness in condizioni semi-naturali, valutazioni di rischio rigorose, e strategie per contrastare l’eventuale resistenza (come usare più gRNA contemporaneamente). Bisogna anche capire ancora meglio la biologia di miR-184. Potremmo persino sfruttare la forte espressione nell’intestino per inserire direttamente nel costrutto miR-184D geni anti-malarici, creando un sistema “tutto in uno”.

Ma il potenziale c’è. Questo approccio basato su miR-184 offre una combinazione unica di caratteristiche che potrebbero renderlo uno strumento potente e versatile nella nostra cassetta degli attrezzi contro la malaria. È una frontiera affascinante della biotecnologia, e sono entusiasta di vedere dove ci porterà.

Fonte: Springer