Fegato: Viaggio al Centro della Rigenerazione – Cosa Ci Svelano i Microarray!
Amici scienziati e curiosi di natura, oggi vi porto con me in un’avventura affascinante nel mondo della biologia, precisamente dentro uno degli organi più incredibili del nostro corpo (e di quello dei topi, in questo caso!): il fegato. Pensate un po’, questo organo è un vero campione di resilienza, capace di rigenerarsi anche dopo averne perso una bella fetta, fino al 70%! Ma come fa? È un mistero che stiamo cercando di svelare pezzetto dopo pezzetto.
Un’Indagine Dettagliata nel Tempo
Immaginate di poter “spiare” cosa succede a livello genetico nel fegato mentre si ricostruisce. È un po’ quello che abbiamo fatto! Abbiamo condotto uno studio su modelli murini (topolini, per gli amici) ai quali è stata praticata un’epatectomia parziale del 70%. In pratica, abbiamo rimosso chirurgicamente una grossa porzione del loro fegato per osservare da vicino questo superpotere rigenerativo. E non ci siamo limitati a un’osservazione superficiale! Abbiamo raccolto dati tramite microarray epatici in un arco temporale che va da 0 (cioè prima dell’intervento) fino a 14 giorni dopo. Questo ci ha permesso di avere una sorta di “diario di bordo” molecolare della rigenerazione.
La cosa davvero interessante è che non ci siamo fermati ai soli dati genetici. Abbiamo meticolosamente misurato il peso corporeo e il peso del fegato di ogni topolino al momento del prelievo. Perché? Perché questo ci dà un’indicazione precisa dello stato di avanzamento dell’ipertrofia compensatoria, ovvero di come il fegato sta “ricrescendo” per compensare la parte mancante. È come avere un metro per misurare la febbre della rigenerazione!
L’Importanza dei Dettagli e delle Repliche
Sapete, nella scienza, i dettagli sono tutto. E quando si studiano processi biologici complessi come la rigenerazione, le differenze individuali possono giocare un ruolo. Per questo, per ogni “tappa” temporale del nostro studio (giorno 0, 1, 2, 3, 4, 7 e 14), abbiamo utilizzato tre “repliche biologiche”, cioè tre topolini diversi. Questo ci aiuta a capire se quello che osserviamo è un fenomeno generale o solo una stranezza di un singolo individuo. È un po’ come chiedere un parere a tre amici diversi prima di prendere una decisione importante!
La qualità dei dati, poi, è fondamentale. Abbiamo verificato che l’RNA estratto dai campioni di fegato fosse di altissima qualità, usando parametri come il RNA integrity number (RIN) e altre statistiche di controllo qualità (QC stats). Immaginate di dover leggere un libro importantissimo: vorreste che le pagine fossero integre e ben stampate, giusto? Ecco, per noi l’RNA è quel libro, e deve essere perfetto per poter “leggere” correttamente l’espressione genica.
I risultati di queste analisi di qualità ci hanno dato il via libera: i dati di microarray erano solidi e affidabili. E a confermarlo ulteriormente sono arrivati i risultati del clustering gerarchico (un modo per raggruppare i campioni simili tra loro) e l’analisi dell’espressione dei geni legati al ciclo cellulare. Questi geni, che sono come i “capocantiere” della divisione e crescita cellulare, hanno mostrato un’attività febbrile proprio quando il fegato era in piena fase di ipertrofia. Un segnale inequivocabile che eravamo sulla strada giusta!
Pensate, il fegato ha questa capacità rigenerativa unica. Dopo la rimozione chirurgica del 70% della sua massa, il tessuto rimanente si ingrandisce grazie alla proliferazione degli epatociti, le cellule principali del fegato, che ne costituiscono circa l’80% della massa. Questi epatociti recuperano il peso perso attraverso l’ipertrofia (aumento di volume) e la proliferazione (aumento di numero) dopo l’epatectomia parziale.
Cosa Ci Dicevano gli Studi Precedenti?
In passato, diversi studi hanno cercato di capire quali fossero gli “interruttori” che attivano la proliferazione degli epatociti. Si è visto, ad esempio, che la supplementazione endovenosa di glucosio, la compensazione di alterate capacità metaboliche o la soppressione dell’accumulo di lipidi potevano inibire questa proliferazione. Questi cambiamenti sono stati quindi considerati come possibili “trigger” necessari. Tuttavia, molti di questi studi si sono concentrati su fenomeni specifici o geni particolari, mancando spesso di una visione d’insieme che collegasse i vari meccanismi. Insomma, il quadro generale del meccanismo regolatorio della proliferazione epatocitaria rimaneva ancora piuttosto nebuloso.
Negli ultimi anni, l’analisi dell’espressione genica su larga scala è diventata cruciale nella biologia e nella ricerca sulla rigenerazione tissutale. In particolare, l’analisi microarray è stata a lungo utilizzata per esaminare l’espressione di geni con sequenze nucleotidiche note. E il bello è che, usando piattaforme simili, si possono confrontare direttamente i nuovi dati con la mole di informazioni accumulate da studi precedenti. Nel modello di epatectomia parziale al 70%, i microarray sono stati usati per confrontare fegati normali con fegati in fase proliferativa, per scovare i geni che controllano la proliferazione degli epatociti, o per esaminare l’espressione genica nel tempo.
Però, c’era un “ma”. Spesso, i dati microarray usati in passato mancavano di repliche biologiche, rendendo impossibile eliminare l’effetto delle differenze individuali nella capacità rigenerativa. Inoltre, questi dati erano associati solo all’informazione temporale, senza essere collegati a un parametro fondamentale come il peso del fegato, cruciale nel modello di epatectomia parziale al 70%.
Il Nostro Contributo: Dati di Qualità e Repliche Biologiche
Ed è qui che il nostro studio ha cercato di fare la differenza. Abbiamo ottenuto un set di dati microarray longitudinali del fegato durante la rigenerazione post-epatectomia in topolini. Abbiamo raccolto RNA di elevata purezza e qualità dopo aver registrato peso corporeo e peso del fegato da tre topolini per ogni punto temporale. Da questo RNA, abbiamo generato set di dati microarray di alta qualità e ne abbiamo valutato i profili di espressione genica.
I risultati hanno indicato che il livello di espressione dei geni correlati al ciclo cellulare aumentava significativamente con l’ipertrofia compensatoria del fegato. Un dato molto rassicurante è che, dopo 14 giorni dalla resezione, non abbiamo estratto geni con espressione significativamente alterata, indicando che i dati riflettevano accuratamente lo stato di “guarigione” e ritorno alla normalità del fegato. Questo ci dice che il nostro set di dati, contenente sufficienti repliche biologiche e collegato al rapporto peso corporeo/peso fegato, sarà utilissimo per delucidare ulteriormente i meccanismi alla base della rigenerazione epatica.
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida etiche e approvati dai comitati competenti. Abbiamo usato topolini C57BL/6N di 10 settimane. L’intervento di epatectomia parziale al 70% è stato eseguito in anestesia con isoflurano, rimuovendo i lobi mediano e laterale sinistro. Successivamente, i topolini sono stati pesati e sacrificati ai tempi stabiliti (giorno 0, 1, 2, 3, 4, 7 e 14 post-intervento) per prelevare i fegati e misurarne il peso.
La Qualità dell’RNA e dei Dati Microarray
Per essere sicuri della bontà dei nostri “ingredienti”, abbiamo analizzato l’RNA. La purezza, misurata con uno spettrofotometro NanoDrop (valori A260/280 tra 1.90 e 2.10), era elevata per tutti i campioni. La qualità, valutata con il sistema Agilent 2100 Bioanalyzer, ha mostrato picchi chiari delle bande ribosomiali 18S e 28S, confermando che l’RNA era integro e adatto per l’analisi microarray. Anche i controlli di qualità sui dati microarray stessi (media del background, fattore di scala, % di geni presenti, rapporto 3′-5′) non hanno mostrato differenze significative tra i campioni, rassicurandoci ulteriormente.
L’analisi di clustering gerarchico ha mostrato che i fegati da 1 a 3 giorni post-resezione si raggruppavano in cluster diversi rispetto ai fegati del giorno 0 (controllo). Inoltre, le tre repliche biologiche per la maggior parte dei campioni formavano cluster unici o molto vicini, a testimonianza della coerenza dei dati, pur tenendo conto delle sottili differenze individuali nel tasso di rigenerazione. Valutando il profilo di espressione genica nel tempo rispetto al fegato normale, abbiamo visto che questo tornava alla normalità entro 14 giorni dalla resezione. Infatti, a 14 giorni non c’erano più geni la cui espressione fosse alterata in modo significativo (più di due volte, con P < 0.05) rispetto al fegato normale.
Geni chiave del ciclo cellulare come Mcm2, Mcm3, Mcm4, Mcm6, Mcm7, Cdk1, Ccnb1, Ccnb2 e Mki67 hanno mostrato un aumento significativo dell’espressione da 1 a 4 giorni dopo la resezione, un periodo che coincide perfettamente con il momento dell’ipertrofia epatica. Questo non fa che confermare l’affidabilità dei nostri dati microarray.
Questo prezioso set di dati è stato depositato nel database Gene Expression Omnibus (GEO) con il numero di accessione GSE278618 ed è accessibile pubblicamente. Crediamo fermamente che queste informazioni contribuiranno a fare luce sui complessi meccanismi della rigenerazione epatica, un campo di ricerca con enormi potenzialità per la medicina.
Fonte: Springer