Farmaci, Fegato e DNA: Ho Scoperto Come il Nostro Codice Segreto Influenza le Reazioni Avverse!

Avete mai pensato perché la stessa medicina può essere un toccasana per una persona e causare effetti collaterali fastidiosi, o addirittura pericolosi, in un’altra? È una domanda che mi affascina da sempre! La risposta, come spesso accade in biologia, è scritta nel nostro DNA. Ma non solo nelle parti che conosciamo meglio, quelle che contengono le istruzioni per costruire le proteine. C’è un intero universo nascosto nel cosiddetto DNA “non codificante”, regioni che per anni abbiamo considerato quasi “spazzatura” e che invece si stanno rivelando dei veri e propri registi dell’attività dei nostri geni.

Nel mio lavoro, mi sono tuffato proprio in questo mondo affascinante, concentrandomi su un organo cruciale per come il nostro corpo gestisce i farmaci: il fegato. In particolare, ho indagato il ruolo di specifici “interruttori” genetici, chiamati elementi cis-regolatori (CRE), che possono essere accesi o spenti proprio dai farmaci che assumiamo. Immaginateli come dei piccoli interruttori della luce sparsi nel nostro genoma, capaci di modulare l’intensità con cui un gene viene “letto” e trasformato in azione.

Come Abbiamo Fatto? Spiare il DNA al Lavoro

Per scovare questi interruttori nascosti e capire come rispondono ai farmaci, abbiamo usato una tecnica super sofisticata chiamata CAGE (Cap Analysis of Gene Expression). In pratica, ci permette di “fotografare” con precisione estrema l’esatto punto in cui inizia la trascrizione di un gene, sia esso un gene che produce una proteina o un RNA non codificante prodotto proprio da questi elementi regolatori (gli enhancer RNA o eRNA). È come ascoltare l’inizio della “musica” genetica per capire quali strumenti (geni ed enhancer) stanno suonando e quanto forte.

Abbiamo condotto i nostri esperimenti su cellule speciali di fegato umano (derivate dalla linea HepG2, ma modificate per esprimere un recettore chiave), trattandole con la rifampicina, un antibiotico noto per attivare un importante “sensore” di farmaci nelle cellule epatiche, il recettore PXR (Pregnane X Receptor). Questo recettore, una volta attivato dal farmaco, si lega al DNA e orchestra l’accensione di geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci stessi e di altre sostanze.

I Registi Indotti dai Farmaci e i Loro Legami Inaspettati

I risultati sono stati sorprendenti! Abbiamo identificato quasi 2.400 CRE la cui attività veniva significativamente aumentata dalla rifampicina. Molti di questi (oltre il 90%!) non erano i classici “promotori” situati proprio all’inizio dei geni, ma elementi regolatori più distanti, i cosiddetti enhancer.

La cosa ancora più interessante è emersa quando abbiamo incrociato i nostri dati con i risultati di grandi studi genetici sulla popolazione (GWAS). Abbiamo scoperto che le regioni contenenti i nostri CRE indotti dai farmaci erano significativamente arricchite di varianti genetiche (SNP) associate a livelli nel sangue di due sostanze molto importanti: la bilirubina (il cui accumulo causa l’ittero) e la vitamina D. Questo ci ha subito suggerito che questi interruttori genetici potessero essere coinvolti proprio in alcune delle reazioni avverse note per farmaci che attivano PXR, come appunto i problemi nel metabolismo della bilirubina o la carenza di vitamina D.

Per essere sicuri che questi CRE fossero direttamente controllati da PXR, abbiamo integrato i nostri dati con mappe preesistenti dei siti di legame di PXR nel fegato umano. Questo ci ha permesso di isolare un gruppo più ristretto di 364 CRE (217 promotori e 147 enhancer) che erano sia indotti dal farmaco sia legati fisicamente da PXR. Li abbiamo chiamati DPP (promotori) e DPE (enhancer). Ben 103 di questi contenevano o erano vicinissimi a SNP associati a tratti misurati negli studi GWAS.

Il Caso UGT1A1: Più Complicato del Previsto

Uno dei geni più noti regolati da PXR e coinvolto nel metabolismo della bilirubina (e di farmaci come l’irinotecano, un antitumorale) è UGT1A1. Era già noto un enhancer importante per questo gene, chiamato PBREM. Ma noi abbiamo fatto delle scoperte in più!

• Abbiamo identificato un nuovo enhancer (che abbiamo chiamato PBREM-like, DPE15) situato più a monte, incredibilmente simile (92% di identità!) al PBREM originale. Probabilmente è frutto di una duplicazione avvenuta nel corso dell’evoluzione. Esperimenti di “spegnimento” genetico (CRISPR/Cas9) hanno dimostrato che anche questo PBREM-like è fondamentale per l’espressione di UGT1A1. Spegnere uno dei due riduceva drasticamente l’attività del gene, spegnerli entrambi la annullava quasi del tutto!
• Abbiamo trovato un altro enhancer cruciale (DPE17), questa volta situato all’interno del gene UGT1A1 stesso (in un introne). Anche la sua rimozione tramite CRISPR riduceva significativamente l’espressione del gene.
• La cosa affascinante è che proprio questo enhancer intronico contiene delle varianti genetiche (SNP) comuni nella popolazione, associate ai livelli di bilirubina. Con esperimenti specifici (saggi luciferasi), abbiamo dimostrato che queste varianti alterano l’attività dell’enhancer: le versioni “alternative” funzionano meno bene di quella di riferimento. Questo spiega a livello molecolare perché alcune persone hanno una predisposizione genetica a metabolizzare meno efficacemente la bilirubina o certi farmaci.
• Infine, abbiamo visto che questi tre enhancer (PBREM, PBREM-like e quello intronico) non agiscono allo stesso modo su tutte le diverse “isoforme” del gene UGT1A (che vengono prodotte dallo stesso locus genico ma con piccole differenze iniziali). L’enhancer intronico sembra essere un attivatore generale per tutte, mentre PBREM attiva alcune isoforme e ne inibisce altre, e PBREM-like sembra più specifico per UGT1A1. Una regolazione incredibilmente complessa!

Vitamina D e CYP24A1: Una Regolazione a Distanza

Un effetto collaterale noto dei farmaci che attivano PXR (come la rifampicina o alcuni antiepilettici) è la carenza di vitamina D. Si pensa che ciò sia dovuto all’aumento dell’espressione di un gene, CYP24A1, che codifica per un enzima che “smaltisce” la vitamina D.

Anche qui, le nostre scoperte aggiungono dettagli importanti. Contrariamente a quanto osservato in alcune linee cellulari tumorali, nel fegato umano “sano” PXR non sembra legarsi direttamente al promotore di CYP24A1. Invece, abbiamo trovato che PXR si lega a degli enhancer situati molto a valle del gene (DPE127-129), in una regione definita come super-enhancer (un cluster di enhancer molto potenti).
Abbiamo confermato che almeno uno di questi enhancer (DPE128) regola effettivamente l’espressione di CYP24A1 nelle nostre cellule epatiche. E, di nuovo, questa regione contiene SNP associati ai livelli di vitamina D nella popolazione. I nostri esperimenti hanno mostrato che le diverse combinazioni alleliche di questi SNP influenzano l’attività di questo enhancer indotta dal farmaco. La versione più comune (aplotipo principale) era la più attiva, mentre le varianti la riducevano, spiegando potenzialmente parte della variabilità individuale nella risposta a questi farmaci e nei livelli di vitamina D.

TSKU: Un Attore Inatteso nella Regolazione della Vitamina D

Ma le sorprese non sono finite! Abbiamo identificato un altro gruppo di enhancer indotti dal farmaco e legati da PXR (DPE70-72), anch’essi associati a varianti genetiche legate ai livelli di vitamina D. Questi enhancer si trovavano a monte di un gene chiamato TSKU (Tsukushi), che codifica per una proteina secreta dal fegato e forse coinvolta nel dispendio energetico.

Abbiamo confermato che questa regione enhancer (anch’essa parte di un super-enhancer) è responsabile dell’aumento di espressione di TSKU indotto dal farmaco. Ma la scoperta più inaspettata è arrivata quando abbiamo provato a “silenziare” il gene TSKU stesso nelle nostre cellule epatiche (usando siRNA). Sorprendentemente, ridurre i livelli di TSKU ha portato a:

• Un aumento dell’espressione di CYP24A1 (l’enzima che degrada la vitamina D).
• Una diminuzione dell’espressione di CYP27A1 e CYP27B1 (enzimi che invece producono la forma attiva della vitamina D).

Questo suggerisce un meccanismo complesso e probabilmente indiretto: PXR attiva TSKU, e la proteina TSKU secreta dal fegato, a sua volta, sembra agire (forse su altre cellule?) per aumentare i livelli complessivi di vitamina D, contrastando l’effetto di degradazione di CYP24A1 e favorendo gli enzimi di attivazione. Un’intera cascata regolatoria che parte dall’interazione farmaco-PXR e arriva a influenzare il metabolismo della vitamina D attraverso un mediatore inatteso!

Perché Tutto Questo è Importante?

Questo studio ci ha permesso di mappare in modo molto più dettagliato il panorama degli “interruttori” genetici nel fegato che rispondono ai farmaci tramite il recettore PXR. Abbiamo scoperto nuovi enhancer cruciali per geni come UGT1A1, abbiamo capito meglio come viene regolato CYP24A1 e abbiamo svelato un ruolo inaspettato per TSKU nel metabolismo della vitamina D.

Soprattutto, abbiamo dimostrato come varianti genetiche comuni, localizzate proprio in questi elementi regolatori non codificanti, possano alterare la risposta individuale ai farmaci, influenzando l’attività di questi interruttori e, di conseguenza, l’espressione dei geni bersaglio. Questo apre nuove strade per:

• Comprendere meglio le basi molecolari delle reazioni avverse ai farmaci (ADR), come l’ittero indotto da farmaci o la carenza di vitamina D.
• Sviluppare approcci di medicina personalizzata, identificando i pazienti a maggior rischio di ADR sulla base del loro profilo genetico non solo nelle regioni codificanti, ma anche in queste cruciali regioni regolatorie.
• Potenzialmente, progettare farmaci più sicuri in futuro.

Insomma, il “lato oscuro” del genoma, quello non codificante, è tutt’altro che oscuro! È un universo vibrante di regolazione fine che determina gran parte di ciò che siamo, inclusa la nostra risposta unica ai farmaci. E aver contribuito a illuminarne un piccolo angolo è stata un’avventura scientifica davvero entusiasmante!

Fonte: Springer