EvolvR: Scateniamo l’Evoluzione Dentro le Nostre Cellule!
Ragazzi, avete mai pensato a come sarebbe poter “accelerare” l’evoluzione, ma farlo direttamente *dentro* le cellule, magari proprio quelle umane o di altri mammiferi? È un po’ il sogno di chi lavora nel campo delle biotecnologie: poter modificare geni specifici per migliorarne la funzione, creare nuove resistenze o studiare malattie in modo super mirato. Questo processo si chiama evoluzione diretta, e tradizionalmente si fa un po’ “a pezzi”: si crea una libreria di varianti genetiche in provetta (tipo con PCR “sbadata” o altri trucchi), si inseriscono queste varianti nelle cellule e poi si selezionano quelle che fanno quello che vogliamo. Figo, ma anche un po’ macchinoso e limitato, soprattutto se le funzioni che cerchiamo dipendono proprio dal contesto specifico della cellula ospite.
I Limiti Attuali: Un Alfabeto Genetico Incompleto
Negli ultimi anni sono nate tecnologie fantastiche per fare evoluzione diretta *in vivo*, cioè direttamente dentro le cellule. Pensate a sistemi basati su CRISPR che usano enzimi chiamati deaminasi. Questi sono bravissimi a fare certe modifiche, specificamente le cosiddette mutazioni di transizione (cambiare una C in T, o una A in G, e viceversa). Utili, certo, ma è come voler scrivere un romanzo potendo usare solo metà delle lettere dell’alfabeto! La stragrande maggioranza delle possibili modifiche proteiche (mutazioni missenso) richiede anche le mutazioni di trasversione (tipo cambiare una C in A o G, o una A in C o T), e con le deaminasi queste sono off-limits. Ci serviva qualcosa di più… versatile.
Ecco EvolvR: La “Fotocopiatrice Sbadata” Guidata da CRISPR
Ed è qui che entro in gioco io, o meglio, la tecnologia che abbiamo sviluppato e chiamato EvolvR. L’idea di base è semplice ma potente: abbiamo preso una versione “delicata” di Cas9, la famosa forbice molecolare di CRISPR. Questa versione, chiamata nickase (nCas9), non taglia entrambi i filamenti del DNA, ma ne fa solo un piccolo “nick”, un taglietto su un singolo filamento, in un punto preciso che decidiamo noi grazie a una guida RNA (gRNA). A questa nickase abbiamo fuso una polimerasi del DNA error-prone, cioè una specie di “fotocopiatrice” molecolare che, mentre ripara il nick e copia il DNA, fa volutamente un sacco di errori, introducendo mutazioni casuali. E la cosa bella è che questa polimerasi non si limita alle transizioni: può generare tutti e 12 i tipi possibili di sostituzione delle basi del DNA!
La Prova del Nove: EvolvR all’Opera nelle Cellule Umane
Ok, l’idea è carina, ma funziona davvero nelle complesse cellule di mammifero? Per scoprirlo, abbiamo messo EvolvR alla prova. Abbiamo usato delle cellule umane (HEK293) che avevano integrato nel loro genoma un gene per una proteina fluorescente blu (BFP). Abbiamo progettato EvolvR per fare un nick vicino a un punto specifico di questo gene, dove una singola mutazione (una C cambiata in T) avrebbe trasformato la proteina blu in una verde (GFP). Abbiamo introdotto EvolvR e la guida RNA nelle cellule e… voilà! Dopo qualche giorno, abbiamo visto comparire cellule verdi! Analizzando il DNA, abbiamo confermato che EvolvR non solo faceva quella specifica mutazione, ma introduceva diversi tipi di mutazioni (sia transizioni che trasversioni) in una finestra di almeno 40 paia di basi attorno al sito del nick. Funzionava! E non solo, abbiamo visto che anche versioni “ridotte” della polimerasi (senza un pezzo chiamato dominio flap endonuclease) funzionavano alla grande, forse anche meglio.
Una Sfida Reale: Creare Resistenza ai Farmaci nel Melanoma
Bello giocare con i colori, ma EvolvR può fare qualcosa di utile nel mondo reale? Abbiamo deciso di affrontare una sfida tosta: evolvere la resistenza a un farmaco antitumorale (selumetinib) in cellule di melanoma (A375). Abbiamo puntato EvolvR su un gene chiave chiamato MAP2K1, noto per essere coinvolto in questo tipo di resistenza. Abbiamo usato tre diverse guide RNA per colpire zone diverse del gene e poi abbiamo trattato le cellule con il farmaco. Le cellule normali morivano, ma dopo un po’ abbiamo visto crescere delle colonie resistenti proprio nelle colture trattate con EvolvR! Analizzando il loro DNA, abbiamo trovato ben sette varianti di MAP2K1 arricchite, sei delle quali erano mutazioni puntiformi che conferivano resistenza. E la cosa pazzesca? Tutte e sei queste mutazioni erano state generate tramite sostituzioni (spesso trasversioni) che le deaminasi non avrebbero potuto creare! Addirittura, una variante era un’inserzione di un amminoacido, mostrando che EvolvR può fare anche piccole inserzioni/delezioni (indel) funzionali. Avevamo scoperto nuove vie di resistenza, inaccessibili con i metodi precedenti.
Il Ruolo Nascosto della Nickase: La “Tolleranza agli Errori”
Mentre analizzavamo i risultati, abbiamo notato una cosa strana. A volte, mutazioni che ci aspettavamo di vedere (come una specifica mutazione nota in MAP2K1) non comparivano da sole, ma solo in combinazione con altre. Questo ci ha fatto pensare. E se la nickase stessa influenzasse il risultato? Abbiamo ipotizzato quello che chiamiamo il “modello di bias da tolleranza al mismatch” (MTB). In pratica: la nickase dovrebbe tagliare solo il DNA bersaglio perfetto. Ma a volte, è un po’ “tollerante” e taglia anche se c’è già una piccola mutazione (un mismatch) nel sito bersaglio introdotta da EvolvR. Se lo fa, la polimerasi error-prone potrebbe usare il filamento non mutato come stampo e… cancellare la mutazione appena fatta! Solo le mutazioni che “disturbano” abbastanza il legame della guida RNA o l’attività della nickase riescono a sfuggire a questo ciclo di “taglia-copia-cancella” e a diventare permanenti. Questo spiegherebbe perché la “fedeltà” della nickase (la sua capacità di tagliare *solo* il bersaglio giusto) è così importante e perché nickasi diverse o guide RNA diverse possono dare risultati differenti. Abbiamo anche visto che usare guide RNA leggermente più corte (18 basi invece di 20) poteva aumentare l’efficienza con la nickase standard (nCas9), probabilmente perché la rendeva meno tollerante ai mismatch, ma non funzionava con nickasi già “migliorate” (enCas9) che sono più sensibili alla lunghezza della guida.
Alla Ricerca della Nickase Perfetta: Flessibilità è la Chiave
Questa dipendenza dalla guida RNA e dalla specifica nickase era un po’ un problema. Volevamo un sistema EvolvR più robusto e versatile. Abbiamo testato un sacco di varianti ingegnerizzate di Cas9, ma i risultati erano molto variabili. La vera svolta è arrivata quando abbiamo provato nickasi derivate da altre proteine Cas9, come Nme2Cas9 e SlugCas9. Quest’ultima si è rivelata particolarmente promettente: era efficiente e sembrava meno “schizzinosa” riguardo alla guida RNA. Ma il vero colpo di genio è stato usare una versione di SlugCas9 ulteriormente ingegnerizzata per essere PAM-flessibile. Cos’è il PAM? È una brevissima sequenza di DNA che Cas9 deve riconoscere accanto al sito bersaglio per poter tagliare. La Cas9 standard (SpCas9) richiede un PAM “NGG”, limitando un po’ i siti dove possiamo dirigerla. La versione di SlugCas9 che abbiamo usato (NNG-Slug-nCas9) riconosce un PAM “NNG” (dove N può essere qualsiasi base), il che significa che possiamo puntare EvolvR praticamente ovunque nel genoma! Questo apre possibilità enormi.
Prevedere il Successo: Una Questione di Energia
Avendo ora una nickase super flessibile, potevamo testare tantissime guide RNA diverse per lo stesso bersaglio (il nostro gene BFP->GFP). Abbiamo notato che l’efficienza di EvolvR variava molto da guida a guida, anche con la stessa nickase. Ci siamo chiesti se ci fosse un modo per prevedere quali guide avrebbero funzionato meglio. Ci siamo ricordati che l’efficienza di CRISPR è legata all’energia necessaria per formare la struttura chiamata “R-loop” (dove la guida RNA si appaia al DNA bersaglio, scalzando l’altro filamento di DNA). Abbiamo calcolato alcuni parametri termodinamici per le nostre guide, in particolare la differenza tra l’energia necessaria per “aprire” la doppia elica del DNA (ΔGO) e l’energia rilasciata quando la guida RNA si lega al DNA (ΔGH). Sorprendentemente, abbiamo trovato una correlazione fortissima: più favorevole era questa differenza energetica (cioè più facile era formare l’R-loop), maggiore era l’efficienza di EvolvR nel generare la mutazione GFP! Questo è fantastico, perché ci dà uno strumento per scegliere a priori le guide RNA più promettenti, risparmiando tempo e fatica.
Il Futuro è Adesso (e si Evolve)
Quindi, cosa abbiamo tra le mani con EvolvR? Abbiamo uno strumento potente e versatile per l’evoluzione diretta *in vivo* nelle cellule di mammifero. Uno strumento che, a differenza dei precedenti, può generare tutti i tipi di mutazioni puntiformi, aprendo spazi di diversità genetica prima inesplorati. Abbiamo dimostrato che può essere usato per scoprire nuove varianti funzionali, come quelle di resistenza ai farmaci. Abbiamo capito che la fedeltà della nickase è un parametro chiave e abbiamo trovato soluzioni (come NNG-Slug-nCas9) per rendere il sistema più robusto e applicabile quasi ovunque nel genoma. E abbiamo persino trovato un modo per prevedere quali guide funzioneranno meglio!
Certo, c’è ancora lavoro da fare. Attualmente, la finestra di mutazione per ogni singola guida RNA è relativamente piccola (decine di paia di basi). Per esplorare regioni più ampie o interi geni, dovremo probabilmente usare più guide RNA contemporaneamente (multiplexing) o ingegnerizzare polimerasi ancora più “processive” (che copiano tratti più lunghi di DNA prima di staccarsi) e sempre error-prone. Ma la strada è tracciata. EvolvR ci offre un modo nuovo ed entusiasmante per “dialogare” con il genoma delle cellule complesse, per capire meglio la biologia e per ingegnerizzare soluzioni innovative in campi che vanno dalla terapia genica alla bioproduzione. Il futuro dell’evoluzione diretta, beh, si sta evolvendo proprio sotto i nostri occhi!
Fonte: Springer
