Segreti nel Genoma: Come ESRRB e gli Enhancer MIR Ridisegnano la Pluripotenza

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel cuore delle nostre cellule, là dove si decide il destino di ogni tessuto e organo. Parleremo di pluripotenza, quella capacità quasi magica delle cellule staminali embrionali (ESC) di trasformarsi in qualsiasi tipo di cellula del corpo. Ma come fanno? E cosa succede quando questa capacità si espande ancora di più, come nelle cellule a potenziale espanso (EPSC), capaci di generare anche tessuti extraembrionali? La risposta, come spesso accade in biologia, è nascosta nell’intricata danza tra geni e la struttura tridimensionale del nostro DNA.

Il Genoma 3D: Un Gomitolo da Sbrogliare

Immaginate il genoma non come una lunga stringa lineare, ma come un complesso gomitolo tridimensionale all’interno del nucleo cellulare. La sua organizzazione spaziale non è casuale: regioni lontane sulla sequenza lineare possono trovarsi vicine nello spazio 3D, creando contatti che accendono o spengono geni specifici. Questo “panorama 3D” è fondamentale per regolare l’espressione genica e decidere il destino di una cellula.

Usando tecniche sofisticate come l’Hi-C (che ci permette di mappare tutti i contatti del genoma) e l’H3K27ac HiChIP (che si concentra sui contatti che coinvolgono regioni attive chiamate enhancer), abbiamo messo a confronto la struttura 3D del genoma nelle cellule staminali embrionali “naïve” (lo stato classico di pluripotenza) e nelle cellule EPSC. Quello che abbiamo scoperto è sorprendente: il paesaggio genomico è decisamente diverso!

• Abbiamo osservato importanti cambiamenti nei cosiddetti compartimenti A/B (regioni genomiche generalmente attive o inattive). In particolare, molte regioni passano da uno stato inattivo (B) a uno attivo (A) quando le cellule passano dallo stato naïve a quello espanso, suggerendo un “rilassamento” generale della cromatina associato a una maggiore potenzialità.
• Anche i domini topologicamente associati (TAD), che sono come dei “quartieri” genomici isolati, mostrano riorganizzazioni significative, soprattutto di tipo complesso o di divisione (split), e molti geni chiave per l’identità cellulare si trovano proprio all’interno di questi TAD riorganizzati.
• Infine, i loop cromatinici, ovvero le anse che mettono in contatto enhancer e promotori (gli interruttori dei geni), sono specifici per ogni stato. Abbiamo notato che le cellule naïve (ESC) sembrano avere un’attività di looping leggermente più intensa, specialmente per quanto riguarda gli enhancer.

Gli Intrusi Diventano Protagonisti: Il Ruolo dei TE

Ma la vera sorpresa arriva quando iniziamo a guardare più da vicino degli strani inquilini del nostro genoma: gli elementi trasponibili (TE). Questi sono frammenti di DNA “saltellanti”, spesso considerati residui di antichi virus o “spazzatura genomica”. Eppure, negli ultimi anni stiamo scoprendo che molti TE sono stati “addomesticati” dall’evoluzione e ora svolgono ruoli regolatori cruciali.

Analizzando i nostri dati 3D, abbiamo notato che una specifica classe di TE, i SINE (Short Interspersed Nuclear Elements), è particolarmente coinvolta nelle regioni cromatiniche attive e nella formazione dei loop, soprattutto nello stato naïve (ESC). Tra questi, spiccano i MIR (Mammalian-wide Interspersed Repeats), una famiglia di SINE molto antica e conservata nei mammiferi.

I MIR sembrano essere dei veri e propri hub di interazione nello stato naïve:

• Sono arricchiti negli ancoraggi dei loop che coinvolgono enhancer attivi (marcati da H3K27ac).
• Questi “MIR-enhancer” sono più accessibili e attivi nelle ESC naïve rispetto alle EPSC.
• Le interazioni che partono da questi MIR-enhancer sono più frequenti e forti nello stato naïve.

I geni vicini a questi loop specifici delle ESC e mediati dai MIR sono coinvolti proprio nella regolazione dello sviluppo. Sembra quindi che questi antichi elementi mobili siano stati cooptati per orchestrare il programma genetico della pluripotenza naïve!

ESRRB: Il Regista che Dirige i MIR

Ma chi “tira i fili” di questi MIR-enhancer? Chi decide quando e come devono interagire? Abbiamo cercato i fattori di trascrizione (TF), le proteine che legano il DNA e regolano i geni, i cui siti di legame (motivi) fossero arricchiti proprio sui MIR coinvolti nei loop enhancer. E un nome è emerso con prepotenza: ESRRB (Estrogen-related receptor beta).

ESRRB è un fattore di trascrizione notissimo per essere essenziale per la pluripotenza e l’auto-rinnovamento delle cellule staminali naïve. Il suo motivo di legame è risultato super arricchito proprio sui MIR-enhancer che formano loop nelle ESC, e si trova in una posizione centrale e conservata all’interno della sequenza MIR. Questo suggerisce un legame funzionale forte e selezionato dall’evoluzione.

Per confermare questa ipotesi, abbiamo usato una tecnica chiamata CAPTURE2.0, basata su CRISPR, che ci permette di “pescare” tutte le proteine legate specificamente ai MIR nel genoma delle ESC. Indovinate un po’? Tra le proteine più arricchite e specifiche per lo stato ESC (rispetto a cellule differenziate) c’era proprio ESRRB, insieme ad altri fattori chiave della pluripotenza come SOX2, OCT4 e KLF5.

L’Importanza Cruciale del Legame ESRRB-MIR nello Stato Naïve

A questo punto, la domanda era: cosa succede se ESRRB non può più legarsi ai MIR o se ESRRB viene a mancare?
Abbiamo osservato che, sebbene ESRRB sia presente sia nelle ESC che nelle EPSC, il suo legame con i TE, e in particolare con i SINE come i MIR, è molto più forte e frequente nello stato naïve (ESC). Quando abbiamo ridotto i livelli di ESRRB nelle ESC (knockdown), le cellule hanno perso le loro caratteristiche staminali e hanno iniziato a differenziarsi. Ma non solo: l’analisi con H3K27ac HiChIP ha rivelato una drastica riduzione dei loop cromatinici mediati da enhancer, specialmente quelli ancorati ai MIR legati da ESRRB! Geni fondamentali per la pluripotenza, come Klf5 e lo stesso Esrrb, perdevano i loro contatti a lungo raggio mediati dai MIR e venivano spenti.

Abbiamo anche esaminato i super-enhancer (SE), regioni genomiche densamente popolate da enhancer che controllano i geni più importanti per l’identità cellulare. Nelle ESC, la perdita di ESRRB ha causato una significativa perdita di loop all’interno dei SE e lo spegnimento dei geni associati. Nelle EPSC, invece, l’impatto era molto minore. Questo rafforza l’idea che ESRRB, attraverso la sua interazione con gli enhancer (molti dei quali derivati da MIR), sia un pilastro specifico della pluripotenza naïve.

Disattivare un Singolo MIR: Conseguenze a Cascata

Per dimostrare definitivamente la funzione di questi MIR-enhancer regolati da ESRRB, abbiamo preso di mira un singolo MIR, situato vicino al gene Klf5 (lo abbiamo chiamato Klf5-MIR), che mostrava un looping differenziale tra ESC ed EPSC e che perdeva i suoi contatti dopo il knockdown di Esrrb. Usando la tecnologia CRISPRi (che permette di “silenziare” specifiche regioni del genoma), abbiamo inattivato Klf5-MIR nelle ESC. Il risultato? L’espressione del gene Klf5 è crollata, così come quella di Nanog (un altro gene chiave della pluripotenza), e abbiamo osservato una riduzione del legame di ESRRB su quel sito.

Ancora più interessante: abbiamo creato cellule ESC in cui Klf5-MIR era completamente eliminato dal genoma (knockout). Queste cellule mostravano una riduzione ancora più drastica di Klf5 e Nanog, crescevano molto più lentamente e avevano difficoltà a mantenere lo stato indifferenziato. Ma quando abbiamo convertito queste stesse cellule knockout nello stato EPSC, la perdita di Klf5-MIR non ha avuto quasi nessun effetto sull’espressione di Klf5 o sulla proliferazione! Questo dimostra in modo lampante che Klf5-MIR è un enhancer funzionale e importante specificamente per lo stato naïve, sotto il controllo di ESRRB.

Un Partner Strutturale: YY1 entra in Scena

Ma ESRRB agisce da solo nel creare questi ponti genomici attraverso i MIR? Abbiamo notato che un’altra proteina, YY1, nota per il suo ruolo generale nell’organizzazione della cromatina e nel mediare contatti enhancer-promotore, si lega spesso ai MIR attivi e ai MIR legati da ESRRB. Esperimenti di co-immunoprecipitazione e ChIP sequenziale hanno confermato che ESRRB e YY1 interagiscono direttamente e si legano insieme su molti siti MIR nel genoma delle ESC.

I geni regolati da questi MIR co-legati da ESRRB e YY1 sono arricchiti per funzioni legate alla pluripotenza. Inoltre, quando abbiamo ridotto ESRRB, abbiamo osservato una diminuzione del legame di YY1 sui siti MIR, anche se i livelli di YY1 non cambiavano. Questo suggerisce che ESRRB potrebbe agire come un “adattatore”, reclutando YY1 su specifici MIR per aiutarlo a stabilire e mantenere i loop cromatinici necessari per l’espressione dei geni della pluripotenza naïve. È come se ESRRB dicesse a YY1: “Ehi, qui c’è un MIR importante, aiutami a creare un contatto con quel gene laggiù!”.

Conclusioni: Un Nuovo Livello di Regolazione

Quindi, cosa ci portiamo a casa da questo viaggio? Abbiamo scoperto un affascinante meccanismo di regolazione specifico per la pluripotenza naïve, basato sull’interazione tra un fattore di trascrizione chiave (ESRRB) e un’antica famiglia di elementi trasponibili (MIR) cooptati come enhancer.
Nello stato naïve (ESC):

• I MIR sono accessibili e attivi come enhancer.
• ESRRB si lega a questi MIR-enhancer.
• Questo legame, spesso in collaborazione con YY1, stabilisce loop cromatinici a lungo raggio che attivano geni essenziali per la pluripotenza e l’auto-rinnovamento.
• La perdita di ESRRB o l’inattivazione di un singolo MIR-enhancer chiave compromette questa rete di interazioni e la stabilità dello stato naïve.

Nello stato a potenziale espanso (EPSC), questa specifica rete regolativa basata su ESRRB-MIR sembra essere meno cruciale.

Questa scoperta non solo svela un nuovo livello di complessità nella regolazione del genoma 3D, ma evidenzia anche come elementi un tempo considerati “spazzatura” possano diventare attori fondamentali nell’evoluzione e nella definizione dell’identità cellulare. Chissà quanti altri segreti simili si nascondono nel nostro DNA, in attesa di essere scoperti!

Fonte: Springer