Batteri al Lavoro: Come Ho Usato i Computer per Trasformare E. coli in una Fabbrica di Acidi Grassi Preziosi

Ciao a tutti! Oggi voglio raccontarvi una storia affascinante che unisce biologia, computer e la ricerca di un futuro più sostenibile. Parliamo di come ho cercato di “convincere” dei minuscoli operai, i batteri Escherichia coli, a produrre per noi delle sostanze chimiche molto utili: gli acidi grassi C12.

Perché proprio gli acidi grassi C12? E perché E. coli?

Viviamo in un mondo che dipende tantissimo dai prodotti petrolchimici, derivati dal petrolio. Il problema è che il petrolio non è infinito e il suo utilizzo, come ben sappiamo, non fa benissimo all’ambiente. Ecco che entrano in gioco gli oleochimici, alternative più “verdi” derivate da acidi grassi, spesso estratti da piante come cocco o colza. Questi composti sono versatili: li troviamo nei farmaci, nelle bioplastiche, persino nei biocarburanti.

Tuttavia, anche la produzione da piante ha i suoi limiti. Coltivare piante apposta per gli oleochimici può entrare in competizione con la produzione di cibo, e la varietà di acidi grassi che le piante offrono è limitata, facendo lievitare i costi. Un esempio? L’acido laurico insaturo (un acido grasso C12 insaturo), molto ricercato ma costoso da ottenere.

Qui entra in scena il nostro piccolo eroe: Escherichia coli. Questo batterio è un po’ il “cavallo di battaglia” della biotecnologia. È relativamente facile da modificare geneticamente, cresce velocemente e può essere trasformato in una vera e propria bio-fabbrica. L’idea è di ingegnerizzarlo per produrre acidi grassi C12 in modo efficiente ed economico, superando i problemi delle fonti vegetali.

La sfida: insegnare a un batterio un nuovo “mestiere”

Modificare il metabolismo di un batterio non è uno scherzo. Bisogna trovare il giusto equilibrio: spingerlo a produrre la sostanza che vogliamo senza stressarlo troppo, altrimenti smette di crescere e la produzione si ferma. È un po’ come chiedere a un maratoneta di portare anche uno zaino pesante: deve essere abbastanza forte da farcela senza crollare.

Tradizionalmente, per trovare i geni giusti da modificare, si usavano metodi sperimentali lunghi e costosi, o si provava a fare delle ipotesi “a tavolino”, ma con migliaia di variabili in gioco, è facile perdersi. Per fortuna, oggi abbiamo strumenti più potenti: i modelli metabolici computerizzati.

Nel mio studio, ho usato il toolbox COBRA (Constraint-based Reconstruction and Analysis) e l’algoritmo Optknock. Immaginate di avere una mappa super dettagliata di tutte le reazioni chimiche che avvengono dentro E. coli (il modello si chiama iML1515, pensate, descrive 2719 reazioni!). Con questi strumenti, possiamo simulare al computer cosa succederebbe se “spegnessimo” (eliminassimo) alcuni geni. L’obiettivo? Trovare le combinazioni di geni da eliminare che spingano il batterio a produrre più acidi grassi C12, mantenendo una crescita decente.

Di per sé, E. coli non produce acidi grassi C12 in quantità significative. Per farglielo fare, gli abbiamo “regalato” un gene speciale, quello per un enzima chiamato tioesterasi BTE, preso da una pianta chiamata Umbellularia californica. Questa tioesterasi è come un paio di forbici molecolari che taglia la catena dell’acido grasso quando raggiunge la lunghezza di 12 atomi di carbonio.

Le previsioni del computer: cosa ci aspettavamo

Armato di questi strumenti computazionali, ho iniziato a “giocare” con il modello di E. coli. Ho simulato l’eliminazione di vari geni, uno alla volta o in combinazione, per vedere l’effetto sulla produzione di C12.
Sono emerse due strategie principali:

• Una mirava a massimizzare solo il flusso verso la produzione di C12.
• L’altra, più sofisticata (usando Optknock), cercava di massimizzare la produzione di C12 e la crescita del batterio.

Il computer ha “suggerito” una serie di geni candidati. Alcuni erano coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio, altri nella sintesi degli amminoacidi aromatici, altri ancora in reazioni che riforniscono il ciclo di Krebs (reazioni anaplerotiche) o nel bilanciamento dei cofattori energetici. Ad esempio, l’algoritmo ha indicato che eliminare geni come acs (acetil-CoA sintetasi), pykA (piruvato chinasi), ndk (nucleoside difosfato chinasi), ldhA (lattato deidrogenasi), deoC, aroC, e maeB, in varie combinazioni, poteva essere vantaggioso. Per esempio, si prevedeva che un mutante senza acs potesse aumentare la produzione di 1.5 volte, mentre un mutante senza ndk e pykA potesse addirittura triplicarla! Un quadruplo mutante (senza ndk, pykA, aroC, maeB) prometteva anch’esso un aumento di tre volte.

Dalla teoria alla pratica: i test in laboratorio

Le previsioni del computer sono fantastiche, ma poi bisogna vedere se funzionano davvero! Così, mi sono rimboccato le maniche e sono passato al laboratorio.
Ho preso il ceppo di E. coli BW25113, ci ho inserito il gene BTE (sotto un promotore inducibile, così potevo controllarne l’espressione) e poi ho creato i vari mutanti “knock-out”, eliminando i geni suggeriti dal computer.

Prima di tutto, ho dovuto trovare la “dose” giusta di induttore (anetotetraciclina) per far esprimere BTE al livello ottimale. Troppo poco, e non produce C12; troppo, e stressa il batterio. Abbiamo visto un picco di produzione di C12 con 100 ng/mL di induttore.

Poi, ho testato i miei mutanti in due condizioni di crescita:

1. Terreno LB (un brodo ricco di nutrienti, soprattutto amminoacidi).
2. Terreno LB con l’aggiunta di 10 g/L di glucosio (uno zucchero semplice, fonte di carbonio preferita da E. coli).

I risultati sono stati super interessanti!

L’effetto del glucosio: una sorpresa!
L’aggiunta di glucosio ha generalmente aumentato la produzione totale di acidi grassi (circa 1.5-2.5 volte di più). Tuttavia, ha cambiato drasticamente il tipo di acidi grassi C12 prodotti.

• Senza glucosio aggiunto (solo LB): circa il 90% degli acidi grassi C12 erano insaturi. Questi sono particolarmente preziosi per l’industria!
• Con glucosio aggiunto: la situazione si è ribaltata! Circa il 90% degli acidi grassi C12 erano saturi.

Questo ci dice che la dieta del batterio influenza non solo quanto produce, ma anche cosa produce. Probabilmente, il glucosio cambia l’espressione di alcuni geni coinvolti nella sintesi degli acidi grassi insaturi.

I campioni in carica: i mutanti migliori

Analizzando i vari mutanti, alcuni si sono distinti:

In terreno LB (senza glucosio aggiunto), dove si ottengono più C12 insaturi:

• La singola delezione di aroL ha triplicato la produzione di C12 rispetto al ceppo di controllo (quello con solo BTE).
• Il doppio mutante ΔndkΔpykA ha mostrato un aumento di circa 3 volte, in linea con le previsioni!
• Ma il vero campione è stato il triplo mutante ΔpykAΔmaeBΔndk: ha aumentato la produzione di acidi grassi C12 di ben 7.5 volte! Questo è l’aumento più alto riportato in letteratura, per quanto ne so.
• Il quadruplo mutante ΔpykAΔmaeBΔaroCΔndk ha dato un aumento di 4 volte.

In terreno LB + glucosio, dove si ottengono più C12 saturi:

• La delezione di ldhA ha dato un piccolo aumento (1.5 volte).
• Il quadruplo mutante ΔaroCΔmaeBΔndkΔpykA è stato il migliore, con un incremento di 2.5 volte nella produzione di C12. È stato anche l’unico a far aumentare la percentuale di C12 sul totale degli acidi grassi.
• Anche qui, il triplo mutante ΔpykAΔmaeBΔndk si è comportato molto bene.

Indipendentemente dal terreno, i migliori produttori sono riusciti a sfornare circa 6.7 mg/L di acidi grassi C12. Non sembra tantissimo, ma considerate che siamo partiti da un ceppo di laboratorio standard, non da uno già super-ottimizzato per la produzione industriale.

Cosa abbiamo imparato e prospettive future

Questo studio dimostra che i modelli computerizzati sono uno strumento potentissimo per l’ingegneria metabolica. Ci hanno permesso di identificare bersagli genetici non ovvi, che hanno portato a miglioramenti significativi nella produzione di acidi grassi C12.

Le delezioni geniche vincenti toccano vie metaboliche cruciali:

• Reazioni anaplerotiche (che riforniscono il ciclo di Krebs, come quelle influenzate da ldhA e maeB).
• Metabolismo degli amminoacidi aromatici (come nel caso di aroA, aroC, aroL). La loro eliminazione in terreno ricco sembra “liberare” precursori per gli acidi grassi.
• Metabolismo centrale del carbonio (come per acs, pykA, deoC). Modificare questi snodi ridistribuisce il flusso di carbonio.
• Bilanciamento dei cofattori (come per ndk). Eliminare ndk potrebbe aumentare l’ATP disponibile, energia cruciale per la sintesi degli acidi grassi.

È interessante notare come l’effetto di alcune delezioni cambi a seconda della presenza di glucosio. Questo sottolinea quanto sia complesso il metabolismo e come l’ambiente di crescita giochi un ruolo fondamentale.

Certo, i modelli hanno dei limiti: non considerano aspetti cinetici o regolatori fini. E i titoli di produzione ottenuti con un ceppo di laboratorio sono lontani da quelli necessari per l’industria (altri studi, con ceppi ingegnerizzati e ottimizzazioni diverse, hanno raggiunto 1.9 g/L di C12).

Tuttavia, il bello è che le strategie identificate qui potrebbero essere trasferite a ceppi industriali già performanti, per vedere se si possono ottenere ulteriori miglioramenti. Immaginate di combinare queste modifiche genetiche con un’ottimizzazione del terreno di coltura e del processo di fermentazione (magari in un bioreattore fed-batch)!

Insomma, abbiamo fatto un altro piccolo passo avanti verso l’utilizzo di microbi come E. coli per produrre sostanze chimiche in modo più sostenibile. La strada è ancora lunga, ma ogni scoperta ci avvicina a un futuro in cui le nostre piccole fabbriche cellulari potrebbero aiutarci a ridurre la dipendenza dal petrolio. E per me, questa è una prospettiva davvero entusiasmante!

Fonte: Springer