DNA Circolare nel Riso: La Nostra Incredibile Scoperta sull’Adattamento allo Stress da Fame!

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel cuore del genoma del riso, una pianta che sfama metà del pianeta. Abbiamo fatto una scoperta che potrebbe cambiare il modo in cui pensiamo all’adattamento delle piante: abbiamo messo sotto la lente d’ingrandimento delle misteriose molecole di DNA chiamate DNA circolare extracromosomico, o più semplicemente eccDNA.

Vi siete mai chiesti come fanno le piante a sopravvivere quando il “cibo” scarseggia? Noi sì, e abbiamo deciso di indagare se questi piccoli anelli di DNA, che vivono fuori dai cromosomi principali, potessero avere un ruolo in questa battaglia per la sopravvivenza, specialmente quando mancano nutrienti fondamentali come l’azoto (N) e il fosforo (P).

Cosa sono questi eccDNA? Un’introduzione

Immaginate il genoma come una grande biblioteca (i cromosomi). Gli eccDNA sono come dei volantini o dei piccoli opuscoli che circolano liberamente, contenenti copie di alcune pagine della biblioteca (geni) o anche sequenze ripetute (elementi trasponibili, o TEs). Sono noti da tempo negli eucarioti, dai lieviti ai mammiferi (purtroppo, anche nelle cellule tumorali dove possono amplificare geni legati al cancro), ma nelle piante coltivate, soprattutto in risposta allo stress ambientale, il loro ruolo era ancora un mistero.

Il riso (Oryza sativa ssp. japonica, per i più precisi) è un modello perfetto per questi studi. È vitale per l’alimentazione globale e il suo genoma è ben conosciuto. Ma durante la crescita, deve affrontare sfide come la carenza di nutrienti. Potevano gli eccDNA essere una sorta di “arma segreta” per adattarsi?

Mappatura del paesaggio degli eccDNA nel riso

Per prima cosa, abbiamo voluto capire come fossero distribuiti questi eccDNA nel riso in condizioni normali, durante diverse fasi di crescita (da 1 a 14 giorni). Abbiamo prelevato campioni dai germogli (le foglie mostrano per prime i sintomi di carenza) e, dopo un’attenta purificazione per eliminare il DNA cromosomico lineare, abbiamo amplificato gli eccDNA con una tecnica chiamata rRCA (Rolling Circle Amplification) e li abbiamo sequenziati usando la tecnologia Nanopore, che permette di leggere sequenze molto lunghe.

Cosa abbiamo trovato? Un sacco di eccDNA! Ne abbiamo identificati quasi 97.000 tipi diversi (molti di più di quanto riportato in studi precedenti!). La maggior parte sono piccoli, tra i 200 e i 600 paia di basi (bp), anche se alcuni arrivano a decine di migliaia di bp. Sono sparsi in tutto il genoma, ma si concentrano particolarmente nelle regioni vicino ai centromeri e in quelle ricche di elementi trasponibili (TEs).

Abbiamo classificato questi eccDNA in base a cosa contenevano:

• Circa il 30% conteneva pezzi di geni (li abbiamo chiamati ecGenes).
• Oltre il 51% conteneva elementi trasponibili (ecTEs).
• Una parte più piccola conteneva RNA non codificanti o sequenze intergeniche.

È interessante notare che una buona parte degli ecGenes conteneva sequenze codificanti (CDS), a differenza di quanto visto ad esempio nelle cellule tumorali umane dove prevalgono le regioni 5’UTR.

Dinamiche degli ecGenes durante la crescita normale

Ci siamo poi chiesti: questo “paesaggio” di eccDNA cambia mentre la pianta cresce? Abbiamo confrontato i campioni prelevati a 1, 3, 7 e 14 giorni in condizioni ottimali. Ebbene sì, cambia! Abbiamo identificato ecGenes che erano presenti esclusivamente in certe fasi.

Ad esempio, confrontando il giorno 1 e il giorno 3, abbiamo trovato centinaia di ecGenes esclusivi. L’analisi funzionale (GO enrichment) ha rivelato che molti erano legati allo sviluppo riproduttivo, al metabolismo (soprattutto dell’azoto) e, sorprendentemente, alla regolazione della fioritura in base alla durata del giorno! Questo suggerisce che gli ecGenes potrebbero giocare un ruolo nel “programmare” lo sviluppo della pianta.

Confrontando il giorno 1 con il giorno 7 (medio termine) e il giorno 14 (lungo termine), abbiamo visto altri cambiamenti. Nel medio termine, sono emerse categorie legate alla sintesi delle proteine (lisil-tRNA aminoacilazione) e allo sviluppo dei fiori. Nel lungo termine, è ricomparsa la categoria del metabolismo dell’azoto e, in modo significativo, quella della risposta al danno al DNA. Forse gli eccDNA aiutano a gestire lo stress genomico che aumenta con l’età?

Abbiamo anche validato la presenza fisica di alcuni di questi ecGenes usando la PCR inversa e il sequenziamento Sanger, confermando la loro struttura circolare.

La risposta allo stress da carenza di Azoto (LN)

Ok, ma cosa succede quando il riso “ha fame” di azoto? L’azoto è cruciale per la crescita. Abbiamo sottoposto le piantine a una dieta povera di N per 3 giorni (breve termine) e 7 giorni (lungo termine).

I risultati sono stati netti! Sotto stress da LN, il numero di ecGenes esclusivi è esploso, soprattutto dopo 3 giorni (quasi 2500!). E l’analisi funzionale ha mostrato un forte arricchimento di categorie legate proprio al metabolismo e al trasporto dell’azoto. Era come se la pianta stesse “ritagliando” e forse amplificando le istruzioni genetiche più utili per cercare e usare quel poco azoto disponibile. Abbiamo trovato ecGenes derivati da geni noti per essere coinvolti nella risposta alla carenza di N, come trasportatori di nitrato (OsNAR2.1), enzimi per l’assimilazione dell’ammonio (OsGOGAT1) e regolatori della crescita (OsTIR1).

Dopo 7 giorni di LN, il numero totale di ecGenes esclusivi era minore, ma la proporzione di quelli specifici per la condizione di stress era ancora più alta. Continuavano ad essere arricchite le categorie legate al trasporto di composti azotati, ma con geni diversi rispetto al breve termine, suggerendo un adattamento continuo.

Abbiamo anche confrontato la presenza di questi ecGenes con l’espressione dei geni corrispondenti sui cromosomi (usando RNA-seq). La relazione è complessa: spesso, quando un ecGene era abbondante nella condizione di stress, il gene cromosomico corrispondente era meno espresso (down-regolato). Questo fa pensare che gli ecGenes possano agire come “silenziatori”, magari producendo piccoli RNA regolatori. Ma non è sempre così, in alcuni casi abbiamo visto l’opposto! C’è ancora molto da capire qui.

La risposta allo stress da carenza di Fosforo (LP)

E per il fosforo? Anche questo è un nutriente essenziale. Abbiamo applicato uno stress da carenza di P per 7 giorni (breve termine) e 14 giorni (lungo termine), tenendo conto che il riso risponde più lentamente alla mancanza di P.

Anche qui, abbiamo visto cambiamenti specifici negli ecGenes esclusivi, sebbene meno drastici rispetto alla carenza di N. Nel breve termine (7 giorni), le categorie GO più arricchite erano legate allo sviluppo dei tessuti e al mantenimento dei meristemi (le zone di crescita attiva). Questo ha senso, perché la carenza di P altera l’architettura della pianta. È emersa anche una categoria legata al trasporto di cationi attraverso le membrane.

Nel lungo termine (14 giorni), abbiamo ritrovato l’arricchimento per il metabolismo dell’azoto (interessante questa connessione tra N e P!), ma la categoria con l’arricchimento più spettacolare (>100 volte!) era la regolazione della macroautofagia, un processo di “riciclo” cellulare che le piante usano in condizioni di stress. Inoltre, era arricchita una categoria legata a complessi enzimatici importanti nella segnalazione cellulare (PI3K).

Anche in questo caso, la relazione con l’espressione genica cromosomica era complessa, con una tendenza alla regolazione negativa ma anche esempi di correlazione positiva, come per il gene OsACP1, noto per essere coinvolto nella risposta alla carenza di P.

Il ruolo degli Elementi Trasponibili (TEs) negli eccDNA

Come accennato, una grande fetta di eccDNA deriva da elementi trasponibili (TEs), i cosiddetti “geni saltellanti”. Abbiamo analizzato più in dettaglio gli ecTEs. In condizioni normali, la maggior parte derivava da trasposoni a DNA (specialmente famiglie Zator e hAT).

Ma sotto stress da LN e LP, abbiamo notato un aumento significativo della proporzione di ecTEs derivati da retrotrasposoni, in particolare della famiglia Gypsy (un tipo di LTR). Questo aumento era più marcato nei trattamenti di stress più lunghi. Sembra che lo stress attivi la mobilizzazione o la circolarizzazione di questi specifici TEs.

Ancora più intrigante è stato guardare gli eccDNA che contenevano un’intera unità ripetuta di un TE (full-length ecRepeatUnits). Qui abbiamo fatto due scoperte notevoli:

• La famiglia di DNA trasposoni Stowaway era molto rappresentata. Il numero di queste unità circolari aumentava sotto stress, ma diminuiva con trattamenti prolungati. Abbiamo anche notato che spesso si trovavano vicino a elementi Tc1-Mariner, suggerendo una possibile interazione per la loro mobilizzazione, forse rendendoli attivi.
• Un’altra famiglia, Kiddo, appariva solo nei campioni sotto stress (LN e LP a 3 e 7 giorni). Anche questi elementi sono ritenuti potenzialmente attivi nel riso.

La formazione di eccDNA da questi TEs potrebbe essere un modo per il genoma di “liberarsi” di elementi potenzialmente dannosi o, chissà, di usarli per regolare altri geni.

I misteriosi eccDNA Multi-Frammento (MF-eccDNAs)

Non tutti gli eccDNA sono semplici cerchi derivati da una singola regione genomica. Abbiamo trovato anche eccDNA composti da due o più frammenti non contigui, a volte provenienti da cromosomi diversi! Li abbiamo chiamati MF-eccDNAs. Sono rari (circa 0.3% delle letture), ma molto interessanti.

Abbiamo identificato alcuni set specifici di MF-eccDNAs. Ad esempio, un gruppo (con un gene del citocromo c ossidasi come “nucleo”) diventava molto abbondante dopo 7 giorni di LN. Un altro (con un gene del citocromo P450) aumentava sia sotto LN che LP a lungo termine. È affascinante pensare a come si formino queste strutture complesse e quale possa essere la loro funzione.

Analizzando le regioni genomiche da cui provenivano i frammenti di alcuni MF-eccDNAs, abbiamo notato un pattern ricorrente: spesso i punti di “rottura” e “ricongiunzione” erano fiancheggiati da LTR (le sequenze ripetute ai lati dei retrotrasposoni). Questo ci ha fatto ipotizzare un meccanismo di formazione basato sulla ricombinazione omologa tra LTR simili ma distanti nel genoma, un po’ come già visto nel lievito. In pratica, il genoma potrebbe usare questi LTR come “punti di aggancio” per tagliare e ricucire pezzi diversi, creando questi mosaici circolari.

Conclusione: Un Nuovo Livello di Plasticità Genomica

Cosa ci dice tutto questo? La nostra ricerca svela che il “mondo” degli eccDNA nel riso è incredibilmente dinamico e risponde in modo specifico sia alle fasi di sviluppo che, soprattutto, allo stress da carenza di nutrienti.

Gli eccDNA sembrano essere uno strumento importante per la plasticità genomica del riso. Attraverso la variazione nell’abbondanza di ecGenes e ecTEs, la pianta potrebbe:

• Regolare finemente l’espressione genica in risposta a segnali ambientali (spesso silenziando, ma a volte forse attivando).
• Modulare l’attività degli elementi trasponibili.
• Creare nuove combinazioni genetiche tramite gli MF-eccDNAs.

Pensiamo che questi meccanismi contribuiscano in modo significativo alla capacità del riso di adattarsi e sopravvivere in condizioni difficili. L’esempio della resistenza al glifosato nell’amaranto, mediata proprio da un eccDNA che amplifica il gene bersaglio dell’erbicida, ci mostra il potenziale enorme di questi piccoli cerchi.

Certo, c’è ancora tanto da scoprire. Come funzionano esattamente gli ecGenes? Producono davvero piccoli RNA? Gli ecTEs circolari sono attivi? Qual è il ruolo preciso degli MF-eccDNAs? Ma crediamo che questo lavoro apra nuove, eccitanti strade per capire l’adattamento delle piante e, magari, per sviluppare in futuro colture più resilienti alla “fame”. È un campo di ricerca in pieno fermento, e noi siamo entusiasti di farne parte!

Fonte: Springer