CRISPR-CasΦ Rivoluziona la Diagnosi: Addio Attese, Ciao Sensibilità Estrema!

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di qualcosa che mi entusiasma da matti nel campo della diagnostica medica. Immaginate un mondo dove possiamo scovare infezioni batteriche pericolosissime, come quelle che causano sepsi (infezioni del sangue o BSI), in un lampo e con una precisione incredibile, anche quando i batteri sono pochissimi. Sembra fantascienza? Beh, tenetevi forte, perché grazie a CRISPR, e in particolare a una sua variante chiamata CasΦ, ci stiamo avvicinando a grandi passi!

Il Problema: Nemici Invisibili e Armi Spuntate

Partiamo dal problema. Le infezioni da patogeni sono una brutta bestia. Pensate che nel 2019, quasi 14 milioni di morti nel mondo erano associate a infezioni, e batteri comuni come *Staphylococcus aureus*, *Escherichia coli* e *Pseudomonas aeruginosa* erano tra i principali colpevoli. Le infezioni del sangue (BSI) sono particolarmente insidiose.

Per scovare questi nemici invisibili, oggi usiamo principalmente due metodi:

• La qPCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa): è veloce, ma spesso non abbastanza sensibile per rilevare le bassissime concentrazioni di DNA batterico presenti, ad esempio, nel sangue all’inizio di un’infezione (parliamo di 1-2 batteri per millilitro!). Questo porta a molti falsi negativi.
• L’emocoltura: è più sensibile, ma richiede giorni, a volte fino a una settimana, per far crescere i batteri in laboratorio fino a un livello rilevabile. Tempo prezioso che, in caso di infezioni gravi, il paziente non ha.

Esistono anche tecnologie più recenti come la T2MR, approvata dalla FDA, che è più rapida dell’emocoltura (3-7 ore), ma richiede apparecchiature e kit specifici e costosi, e si basa comunque su una pre-amplificazione del DNA. Insomma, c’era un disperato bisogno di qualcosa di meglio: un test ultra-sensibile, rapido (meno di un’ora), eseguibile magari anche fuori da un laboratorio super attrezzato (Point-of-Care, POC), accurato e a basso costo.

L’Idea Geniale: Sfruttare le Forbici Molecolari CRISPR

Qui entra in gioco CRISPR! Probabilmente ne avete sentito parlare per l’editing genetico, ma i sistemi CRISPR-Cas sono anche fantastici strumenti diagnostici. Tecnologie come DETECTR e SHERLOCK hanno aperto la strada, ma spesso richiedono ancora una fase di pre-amplificazione del materiale genetico (con metodi come LAMP o RPA), il che complica un po’ le cose.

La nostra sfida era: come ottenere una sensibilità pazzesca senza dover amplificare il DNA o l’RNA del patogeno? L’idea è stata quella di potenziare un’abilità intrinseca di alcune proteine Cas, in particolare della famiglia Cas12 (e la nostra star, CasΦ, ne fa parte): la cosiddetta attività di taglio collaterale (collateral cleavage).

Cosa significa? Quando la proteina CasΦ, guidata da un RNA guida (gRNA) specifico, riconosce e si lega al DNA bersaglio (quello del patogeno), si “accende” e inizia a tagliare non solo il bersaglio, ma anche altre molecole di DNA a singolo filamento (ssDNA) presenti nei dintorni, in modo non specifico. È come se, trovata la serratura giusta (il DNA patogeno), la chiave (CasΦ+gRNA) iniziasse a girare all’impazzata aprendo anche altre porte vicine (tagliando altri ssDNA).

Ecco TCC: Il Nostro Nuovo Super-Strumento

Basandoci su questo principio, abbiamo sviluppato un metodo che abbiamo chiamato TCC (Target-amplification-free Collateral-cleavage-enhancing CRISPR-CasΦ). Il nome è un po’ tecnico, ma l’idea è potente: abbiamo creato un sistema che amplifica enormemente il segnale di taglio collaterale, senza toccare il DNA originale del patogeno.

Come funziona? È un “balletto” molecolare affascinante:

1. Riconoscimento: Il DNA del patogeno (liberato dalla lisi delle cellule batteriche) viene riconosciuto da un primo complesso CRISPR-CasΦ (chiamiamolo RNP1).
2. Prima Attivazione: Questo legame attiva l’attività di taglio collaterale di CasΦ in RNP1.
3. Taglio dell’Amplificatore: CasΦ attivato inizia a tagliare due cose:
   • Un reporter fluorescente: una molecola con un colorante (fluoroforo) e uno “spegnitore” (quencher) legati da un pezzetto di DNA. Quando il legame viene tagliato, il colorante si libera e inizia a brillare. Questo è il segnale che misuriamo.
   • Un amplificatore TCC: questa è la nostra invenzione chiave! È una molecola di DNA speciale, progettata con due strutture a “forcina” (stem-loop). Quando CasΦ taglia queste forcine, l’amplificatore si “apre”.
4. Seconda Attivazione: Il prodotto del taglio dell’amplificatore viene riconosciuto da un secondo complesso CRISPR-CasΦ (RNP2), attivando anch’esso.
5. Amplificazione a Cascata: Ora abbiamo sia RNP1 che RNP2 attivi che tagliano furiosamente il reporter fluorescente, generando un segnale luminoso molto più intenso e rapido. È un ciclo che si autoalimenta: più amplificatore viene tagliato, più RNP2 si attiva, più reporter viene tagliato, più segnale otteniamo!

Il bello è che tutto avviene in un’unica provetta (one-pot), a temperatura costante (isotermica, 37°C), e senza bisogno di amplificare il DNA del patogeno. Abbiamo ottimizzato ogni componente: la proteina CasΦ, gli RNA guida, la sequenza e la struttura dell’amplificatore (scoprendo che una “forcina” di 8 nucleotidi era perfetta) per massimizzare l’efficienza e ridurre il rumore di fondo.

Messo alla Prova: Risultati da Urlo!

E i risultati? Semplicemente sbalorditivi.

• Sensibilità Estrema: Siamo riusciti a rilevare frammenti di DNA del gene nuc di *Staphylococcus aureus* fino a 0.18 attomolare (aM). Per darvi un’idea, sono circa 0.11 copie di DNA per microlitro! Un miglioramento di 6 ordini di grandezza rispetto al solo CasΦ senza il nostro sistema TCC.
• Rilevamento Batteri: Applicando il metodo a batteri interi (dopo una semplice lisi termica), abbiamo rilevato *S. aureus*, *E. coli*, *K. pneumoniae* e *P. aeruginosa* fino a una concentrazione bassissima di 1.2 CFU/mL (Unità Formanti Colonia per millilitro). La qPCR, con lo stesso campione, non riusciva a scendere sotto le 10.000-100.000 copie/mL!
• Velocità: L’intero processo, dalla lisi del campione alla lettura del risultato, richiede solo 40 minuti.
• Specificità: Il sistema TCC ha dimostrato un’ottima capacità di distinguere sequenze di DNA con anche una sola base diversa (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) e di riconoscere specificamente il patogeno target anche in presenza di altri batteri.

Dal Laboratorio al Paziente: La Sfida Clinica

Ok, funziona alla grande in laboratorio, ma sui pazienti reali? Abbiamo testato TCC su campioni di siero provenienti da 50 pazienti, alcuni con infezioni del sangue confermate (da *E. coli*, *K. pneumoniae*, *S. aureus*), altri sani o con altre infezioni. Abbiamo messo a punto un protocollo rapido per concentrare i batteri dal siero e poi applicato TCC.

I risultati sono stati eccellenti:

• Per *E. coli*, TCC ha identificato correttamente tutti i 24 pazienti positivi (sensibilità 100%) e 23 su 26 pazienti negativi (specificità 88.64%), confrontando con i risultati dell’emocoltura seguita da MALDI-TOF MS (il gold standard ospedaliero, anche se lento).
• La qPCR, sugli stessi campioni, ha fallito miseramente, non riuscendo a rilevare i positivi a causa della bassa concentrazione batterica nel siero (che abbiamo stimato tra 1.23 e 156.77 CFU/mL nei positivi).
• TCC ha anche identificato correttamente i pazienti positivi per *K. pneumoniae* e *S. aureus*, dimostrando la sua specificità anche in un contesto clinico complesso.

Questo dimostra che TCC ha il potenziale per diagnosticare infezioni del sangue direttamente dal siero, molto più rapidamente e con maggiore sensibilità rispetto ai metodi attuali per basse cariche batteriche.

Diagnosi Tascabile: Il Futuro è Portatile

Per rendere TCC veramente utile come strumento Point-of-Care, abbiamo sviluppato un prototipo di dispositivo portatile per la rilevazione della fluorescenza, che abbiamo chiamato “TCC Device”. Lo abbiamo testato sugli stessi campioni di siero dei pazienti e i risultati sono stati perfettamente sovrapponibili a quelli ottenuti con il lettore di micropiastre da laboratorio. Questo apre la porta a diagnosi rapide e accurate direttamente sul campo o in ambulatori con risorse limitate.

Cosa Ci Aspetta? Limiti e Prossimi Passi

Certo, c’è ancora lavoro da fare. Attualmente, usiamo un singolo gRNA per riconoscere un patogeno, il che potrebbe essere limitante per lo screening di patogeni sconosciuti o meno comuni. Stiamo pensando a come integrare più guide o combinare TCC con altre tecnologie, come la microfluidica, per analisi high-throughput. L’intelligenza artificiale potrebbe aiutarci a progettare gRNA e proteine Cas ancora più performanti. Potremmo anche estendere il metodo al rilevamento di RNA, come i microRNA.

Nonostante queste sfide future, credo fermamente che TCC rappresenti un passo avanti significativo. Offre una combinazione di sensibilità, velocità, semplicità e potenziale basso costo che potrebbe davvero rivoluzionare la diagnosi delle malattie infettive, specialmente quelle insidiose come le infezioni del sangue. Poter avere una diagnosi accurata in meno di un’ora invece che in giorni potrebbe fare un’enorme differenza per la vita dei pazienti. Stiamo lavorando per trasformare questa promessa in realtà!

Fonte: Springer