Vermi, Computer e Speranza: A Caccia del Vaccino Contro l’Ancylostoma duodenale con la Bioinformatica!

Amici scienziati e curiosi di ogni sorta, preparatevi per un’avventura nel mondo microscopico dei parassiti e nella potenza della bioinformatica! Oggi vi racconto come, armati di algoritmi e database, stiamo cercando di mettere all’angolo un nemico insidioso: l’Ancylostoma duodenale. Sì, lo so, il nome non è dei più rassicuranti, e a ragione! Parliamo di un verme parassita che, zitto zitto, infesta l’intestino di milioni di persone, causando anemie, malnutrizione e un sacco di altri problemi, soprattutto nei paesi più poveri. Un vero osso duro.

Chi è questo Ancylostoma duodenale? Un Identikit del Nemico

Immaginate un piccolo verme nematode, noto anche come “anchilostoma del Vecchio Mondo”. Questo tipetto non è un ospite gradito: si attacca alle pareti del nostro intestino tenue e, letteralmente, si nutre del nostro sangue. Le sue uova vengono espulse con le feci e, in condizioni ambientali favorevoli (terreno umido, clima caldo), si schiudono liberando larve infettive. Queste larve possono penetrare la pelle umana, magari attraverso piccole abrasioni, oppure essere ingerite. Una volta dentro, è un viaggio verso l’intestino, dove diventano adulti e il ciclo ricomincia. Pensate che nel 2016, si stimava che circa 450 milioni di persone nel mondo fossero infette! Le popolazioni più a rischio? Bambini in età prescolare e scolare, e chi vive in aree con scarse condizioni igienico-sanitarie, soprattutto in Asia e nella regione del Pacifico. Le conseguenze dell’infezione, chiamata ancilostomiasi, non sono da sottovalutare: anemia da carenza di ferro (storicamente nota come ‘clorosi egiziana’), malnutrizione proteica, ritardi nello sviluppo cognitivo e nella crescita, specialmente nei bambini. Insomma, un problema di salute pubblica non da poco.

La Sfida: Farmaci Sì, Ma la Resistenza Avanza

Certo, abbiamo delle armi. Farmaci antielmintici come l’albendazolo, il pirantel pamoato, l’ivermectina e il mebendazolo sono efficaci nell’eliminare i vermi adulti. L’albendazolo, ad esempio, blocca l’assorbimento di glucosio da parte del parassita, portandolo alla morte per “fame energetica”. Il pirantel pamoato, invece, provoca una paralisi spastica nei vermi. Tutto bello, se non fosse per due grossi “ma”:

• Effetti collaterali: nausea, vomito, dolori addominali, mal di testa… non proprio una passeggiata.
• Resistenza ai farmaci: ahimè, come per i batteri con gli antibiotici, anche questi parassiti stanno diventando furbi. L’aumento della resistenza, soprattutto all’albendazolo, è una preoccupazione crescente, specialmente nelle campagne di sverminazione di massa.

E un vaccino? Nonostante gli sforzi, ad oggi non esiste un vaccino commerciale approvato dalla FDA per proteggerci. Ci sono stati tentativi, come quelli basati sulle proteine Na-APR-1 e Na-GST-1, ma hanno incontrato ostacoli come bassa resa produttiva, necessità di adiuvanti potenti e somministrazioni multiple. Chiaramente, c’è un vuoto da colmare, una necessità impellente di nuove strategie.

La Bioinformatica Scende in Campo: La Nostra Indagine Digitale

Ed è qui che entriamo in gioco noi, con il nostro approccio di “decodifica guidata dalla bioinformatica”. In pratica, abbiamo usato un arsenale di strumenti computazionali per scandagliare il genoma dell’Ancylostoma duodenale alla ricerca di punti deboli, di potenziali bersagli per un vaccino. Immaginatela come una gigantesca caccia al tesoro digitale! Per prima cosa, abbiamo scaricato il genoma di riferimento del parassita (ceppo Zhejiang, con ben 27.484 proteine!) dal National Center for Biotechnology Information (NCBI). Poi, abbiamo iniziato a “interrogarlo”.

Abbiamo cercato proteine essenziali per la sopravvivenza del parassita e quelle coinvolte nelle interazioni ospite-parassita. Perché proprio queste? Semplice: se blocchiamo qualcosa di vitale per il verme o un suo “strumento” per interagire con noi, abbiamo buone chance di fermarlo. Con strumenti come BLASTp, abbiamo confrontato queste proteine con database di geni essenziali (DEG) e di interazioni proteina-proteina ospite-parassita (HPPPI). Abbiamo impostato dei criteri molto stringenti (bitscore > 100, E-value < 1e-20, ecc.) per essere sicuri di pescare solo i "pesci grossi", quelli con rilevanza biologica significativa.

Un passo cruciale è stato eliminare le proteine del parassita troppo simili a quelle umane. Non vogliamo mica che il vaccino attacchi per sbaglio il nostro stesso organismo! Quindi, via di BLASTp contro il proteoma umano. E non solo: abbiamo fatto lo stesso controllo anche contro il microbioma intestinale umano, per evitare interferenze indesiderate. Alla fine di questa prima, massiccia scrematura, siamo rimasti con 36 proteine “uniche” del parassita, non omologhe all’uomo e al suo microbioma intestinale. Un bel gruppetto di sospetti!

Indiziati Speciali: Le Proteine di Superficie e la Caccia agli Epitopi

Tra queste 36 proteine, dovevamo capire quali fossero i migliori candidati per un vaccino. Abbiamo analizzato le loro “residenze” cellulari (localizzazione subcellulare) usando tool come DeepLoc e BUSCA. Perché? Perché le proteine che si trovano sulla membrana esterna o nello spazio extracellulare del parassita sono le più esposte al nostro sistema immunitario, quindi bersagli ideali. Ne abbiamo individuate 6 particolarmente promettenti, situate proprio lì, “in prima linea”.

Queste 6 candidate sono state poi passate al setaccio per valutarne l’antigenicità (cioè la capacità di stimolare una risposta immunitaria, usando VaxiJen 2.0), l’allergenicità (non vogliamo reazioni allergiche, quindi via libera solo a quelle non allergeniche secondo AllerTOP) e altre caratteristiche fisico-chimiche. Alla fine, due proteine hanno superato brillantemente tutti i test, emergendo come le nostre “superstar”: KIH49483.1 (una proteasi aspartica eucariotica) e KIH58423.1 (una proteina con dominio recettoriale per lipoproteine a bassa densità di classe A). Queste sono diventate la base per il design del nostro vaccino multi-epitopo.

Cosa sono gli epitopi? Sono piccole porzioni di queste proteine che vengono riconosciute specificamente dalle cellule del nostro sistema immunitario (linfociti T e B). È come se fossero le “impronte digitali” del parassita. Abbiamo usato database e strumenti come IEDB per predire gli epitopi più promettenti per i linfociti T (sia quelli che attivano i linfociti T helper, HTL, sia quelli per i linfociti T citotossici, CTL) e per i linfociti B (che producono anticorpi). Abbiamo selezionato quelli più antigenici, non tossici e, per gli epitopi MHC di classe II, quelli capaci di indurre citochine importanti come l’interferone-gamma (IFN-γ).

Costruire il Vaccino “Chimerico”: Un Cocktail di Epitopi, Linker e Adiuvanti

Una volta identificati i migliori epitopi T e B dalle nostre due proteine “superstar”, è arrivato il momento di assemblarli. Non basta metterli insieme a caso! Abbiamo usato dei “linker” specifici (sequenze di amminoacidi come AAY, GPGPG, KK) per collegare i diversi tipi di epitopi, in modo da ottimizzare la loro presentazione al sistema immunitario e la loro processazione. Ad esempio, i linker AAY aiutano la presentazione degli epitopi CTL, mentre i GPGPG sono ottimi per gli epitopi HTL.

Ma un vaccino efficace ha bisogno anche di una “scossa” per il sistema immunitario, qualcosa che lo allerti e potenzi la risposta. Ecco che entrano in gioco gli adiuvanti. Ne abbiamo testati sei diversi, tra cui la beta-defensina-3, la proteina ribosomiale L7/L12, la flagellina, e l’HBHA. Combinando gli epitopi selezionati, i linker e ciascuno di questi adiuvanti, abbiamo progettato sei diversi costrutti vaccinali chimerici (li abbiamo chiamati da V1 a V6). L’idea è creare un vaccino che possa indurre sia una risposta immunitaria cellulare (mediata dai linfociti T) sia umorale (mediata dagli anticorpi prodotti dai linfociti B).

Questi sei “progetti” di vaccino sono stati poi analizzati al computer per le loro proprietà fisico-chimiche (peso molecolare, stabilità, solubilità – tutti fattori cruciali per la produzione), antigenicità e allergenicità. Volevamo essere sicuri che fossero stabili, solubili, altamente antigenici e, ovviamente, non allergenici. Abbiamo anche predetto la loro struttura secondaria (alfa-eliche, beta-foglietti) e terziaria (la forma 3D complessiva), usando server come SOPMA e trRosetta, raffinando poi i modelli 3D con GalaxyRefine. La qualità di questi modelli è stata verificata con punteggi ERRAT e grafici di Ramachandran: i nostri modelli erano di alta qualità, pronti per il passo successivo.

Simulazioni al Computer: Il Vaccino Incontra il Sistema Immunitario (Virtualmente)

Avere un bel progetto 3D è un conto, ma come interagirà questo vaccino con le cellule immunitarie umane? Per scoprirlo, abbiamo eseguito simulazioni di “molecular docking”. In pratica, abbiamo fatto “attraccare” i nostri costrutti vaccinali a recettori chiave del sistema immunitario innato, come i Toll-Like Receptors TLR4 e TLR5. Questi recettori sono come delle sentinelle sulle nostre cellule immunitarie. Abbiamo cercato i complessi vaccino-recettore con la più alta affinità di legame (punteggi di docking più bassi indicano un legame più forte).

I costrutti V2 (con adiuvante proteina ribosomiale L7/L12) e V3 (con adiuvante flagellina) sono emersi come i più promettenti, mostrando ottimi punteggi di docking e numerose interazioni con TLR4 (per V2) e TLR5 (per V3). Questi due “campioni” sono stati quindi sottoposti a simulazioni di dinamica molecolare (MD) per 200 nanosecondi. Immaginate di filmare al rallentatore come il vaccino e il recettore si muovono e interagiscono in un ambiente acquoso che simula le condizioni fisiologiche. Abbiamo analizzato parametri come RMSD (Root Mean Square Deviation) e RMSF (Root Mean Square Fluctuation) per valutare la stabilità e la flessibilità dei complessi. I risultati? Entrambi i complessi V2-TLR4 e V3-TLR5 si sono dimostrati stabili durante la simulazione, un ottimo segno!

Abbiamo anche condotto analisi PCA (Principal Component Analysis) e DCCM (Dynamic Cross-Correlated Matrix) per capire meglio i movimenti coordinati e i cambiamenti conformazionali dei complessi. L’analisi dell’energia libera di legame MM/GBSA per il complesso V1-TLR4 (un altro candidato analizzato in dettaglio, probabilmente V2-TLR4 nel testo originale, c’è una piccola discrepanza qui ma il concetto è lo stesso) ha confermato una forte affinità di legame. Inoltre, abbiamo predetto gli epitopi B conformazionali sui nostri costrutti vaccinali, ovvero quelle regioni superficiali che si formano grazie al ripiegamento della proteina e che sono cruciali per il riconoscimento da parte degli anticorpi.

Verso un Vaccino Globale e la Prova del Nove (Simulata)

Un aspetto fondamentale è la copertura della popolazione. Gli alleli HLA (i geni che codificano per le molecole che presentano gli epitopi ai linfociti T) variano molto tra le diverse etnie. Abbiamo usato lo strumento Population Coverage dell’IEDB per verificare che gli epitopi T selezionati potessero essere riconosciuti da una vasta porzione della popolazione mondiale. Ebbene, i nostri epitopi hanno mostrato una copertura stimata del 99.74% della popolazione globale! Fantastico, no?

Pensando a una futura produzione, abbiamo ottimizzato i codoni delle sequenze dei nostri vaccini V2 e V3 per l’espressione nel batterio E. coli K12 (un “cavallo di battaglia” per la produzione di proteine ricombinanti). Questo migliora l’efficienza della sintesi proteica. Abbiamo anche simulato l’inserimento dei geni del vaccino in un vettore plasmidico (pET-28a(+)), un passo standard per la clonazione.

Infine, la prova del nove (virtuale, per ora!): la simulazione immunitaria con C-ImmSim. Abbiamo simulato la somministrazione di tre dosi dei vaccini V2 e V3 e analizzato la risposta immunitaria prevista. I risultati sono stati entusiasmanti! Entrambi i vaccini hanno indotto un aumento significativo di anticorpi (IgG, IgM), l’attivazione di linfociti T helper (TH1 e TH2), la produzione di citochine importanti (come IFN-γ, IL-2, IL-10) e la proliferazione di cellule B di memoria. Questo suggerisce che i nostri vaccini potrebbero stimolare efficacemente sia l’immunità innata che quella adattativa.

Cosa Ci Aspetta? Dalla Teoria alla Pratica

Certo, tutto questo lavoro è stato fatto in silico, cioè al computer. È un primo passo fondamentale, che ci ha permesso di risparmiare tempo e risorse, concentrandoci sui candidati più promettenti. Ma la bioinformatica, per quanto potente, non sostituisce la validazione sperimentale. Il prossimo, cruciale passo sarà testare questi costrutti vaccinali (V2 e V3 in particolare) in laboratorio: studi in vitro per confermare la loro immunogenicità e poi studi preclinici in vivo (su modelli animali) per verificarne la sicurezza e l’efficacia protettiva contro l’infezione da Ancylostoma duodenale.

Siamo ottimisti. L’approccio che abbiamo seguito, combinando proteomica sottrattiva e vaccinologia inversa, ha già dato buoni frutti per altri patogeni. La nostra ricerca ha gettato le basi per lo sviluppo di un vaccino basato su epitopi contro questo parassita così diffuso e dannoso. La strada è ancora lunga, ma la speranza di avere un giorno un’arma efficace contro l’ancilostomiasi è un po’ più concreta. E tutto grazie a un’attenta “decodifica” dei segreti nascosti nel suo genoma!

Fonte: Springer