Microambiente Immunitario Sotto la Lente: Decifrare Tessuti e Tumori con la Deconvoluzione

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi in un viaggio affascinante nel cuore dei nostri tessuti, in particolare nel complesso mondo del microambiente immunitario, soprattutto quando si parla di tumori. Capire chi sono gli “attori” immunitari presenti in un tumore è fondamentale, pensate un po’, per far funzionare meglio le nuove terapie contro il cancro, come l’immunoterapia.

La Sfida: Un Puzzle Complicato

L’immunoterapia ha fatto passi da gigante, ma diciamocelo, non funziona per tutti e non per tutti i tipi di cancro. Uno dei motivi principali è proprio la complessità del microambiente immunitario tumorale. È come cercare di capire chi c’è in una stanza affollatissima guardando solo dal buco della serratura. Le tecniche tradizionali, come la citometria a flusso o l’immunocitochimica, ci danno qualche indizio basato su pochi marcatori noti, ma ottenere un quadro completo di tutte le cellule immunitarie presenti è un vero rompicapo.

Con l’avvento delle tecnologie high-throughput, come il sequenziamento dell’RNA (RNA-seq), abbiamo iniziato ad avere molti più dati a disposizione – un’intera “lista della spesa” di geni espressi nel tessuto. Da qui sono nati metodi bioinformatici per provare a “deconvolvere” questi dati, cioè a separare i segnali provenienti dai diversi tipi di cellule immunitarie mescolati insieme nel campione “bulk” (l’intero pezzo di tessuto). Pensatela come cercare di distinguere le voci dei singoli cantanti in un coro ascoltando solo la registrazione complessiva.

Metodi come CIBERSORT hanno aperto la strada, ma presentavano ancora limiti, soprattutto nella precisione per alcuni tipi cellulari specifici. Inoltre, per chi non è un bioinformatico di professione, districarsi tra hardware, software, pipeline complesse, formati di file incompatibili e versioni diverse di genomi di riferimento può diventare un incubo!

La Nostra Soluzione: Un Flusso di Lavoro Semplificato in Due Passi

Proprio per superare queste difficoltà, abbiamo sviluppato un approccio più snello e, oserei dire, più amichevole. Si tratta di un flusso di lavoro in due fasi, pensato per rendere l’analisi del microambiente immunitario accessibile anche ai ricercatori “da banco”.

Il primo passo si chiama DOCexpress_fastqc. È un toolkit “dockerizzato” (quindi facile da installare e usare su qualsiasi computer) basato sull’architettura aperta di Galaxy. Cosa fa? Prende i dati grezzi di RNA-seq e li processa fino ad ottenere il profilo di espressione genica. Lo fa utilizzando pipeline consolidate (hisat2-stringtie) e include anche un controllo di qualità (FastQC) per essere sicuri che i dati di partenza siano buoni. La cosa bella è che ha un’interfaccia utente grafica, quindi niente più mal di testa da riga di comando! E soprattutto, l’output è già formattato perfettamente per il secondo passo.

Il secondo passo è mySORT, un’applicazione web che prende i dati processati da DOCexpress_fastqc e fa la magia della deconvoluzione. Utilizzando un algoritmo ottimizzato da noi, mySORT stima le proporzioni relative di ben 21 sottoclassi di cellule immunitarie. Non si ferma qui: offre anche una serie di visualizzazioni fantastiche!

Come Funziona mySORT e Cosa Ci Mostra?

L’idea alla base di mySORT è usare un set di “geni firma”, cioè geni che sono espressi in modo caratteristico da specifici tipi di cellule immunitarie. Analizzando l’espressione di questi geni nel campione bulk, l’algoritmo riesce a stimare quanto contribuisce ogni tipo cellulare al segnale totale.

Ma i numeri da soli possono essere aridi. Per questo mySORT offre:

• Tabelle e grafici a barre impilate che mostrano la composizione percentuale di cellule immunitarie per ogni campione.
• Clustering gerarchico: raggruppa i campioni simili in base alla loro composizione immunitaria, aiutando a identificare pattern.
• Analisi della diversità: utilizza indici come l’alfa-diversità (quanto è vario il “parco” di cellule immunitarie all’interno di un singolo campione) e la beta-diversità (quanto sono diverse le composizioni immunitarie tra campioni diversi), visualizzate con grafici intuitivi come gli NMDS plot. Questo ci dà un’idea della complessità e dell’eterogeneità delle popolazioni immunitarie.

Validazione: Funziona Davvero?

Ovviamente, non basta dire che funziona, bisogna dimostrarlo! Abbiamo messo alla prova mySORT in modo rigoroso. Come? Abbiamo preso dati pubblici di sequenziamento a singola cellula (scRNA-seq) da pazienti con melanoma e cancro della testa e del collo. La scRNA-seq analizza le cellule una per una, quindi conosciamo la “verità” (ground truth) sulla composizione cellulare di quei campioni.

Abbiamo poi creato dei dati “pseudo-bulk” aggregando i dati delle singole cellule per ogni paziente, e abbiamo dato questi dati in pasto a mySORT. I risultati sono stati ottimi! Le stime di mySORT erano fortemente correlate con la composizione reale: abbiamo raggiunto coefficienti di correlazione di Pearson di 0.871 nel melanoma e 0.775 nel cancro testa-collo. Confrontando mySORT con CIBERSORT sugli stessi dati, abbiamo visto che il nostro metodo è spesso più accurato e offre visualizzazioni molto più ricche. Abbiamo testato mySORT anche su dati scRNA-seq di cancro al polmone non a piccole cellule (NSCLC), ottenendo buoni risultati anche lì, dimostrando la sua applicabilità a diversi set di dati e piattaforme.

Accessibilità e Prospettive Future

La cosa più importante per noi è che questi strumenti siano utili alla comunità scientifica. Per questo, sia DOCexpress_fastqc (come immagine Docker) che mySORT (come applicazione web demo e immagine Docker) sono liberamente disponibili per uso accademico. Vogliamo abbattere le barriere tecniche e permettere a più ricercatori di esplorare il microambiente immunitario.

Certo, c’è sempre spazio per migliorare. Abbiamo notato, ad esempio, che la predizione per i macrofagi potrebbe essere affinata. Questo probabilmente è dovuto alla loro bassa rappresentazione in alcuni dei dataset usati per “allenare” il modello. Il nostro lavoro futuro si concentrerà sull’integrare dataset più ampi e di alta qualità, magari provenienti proprio dalla scRNA-seq, per migliorare ulteriormente le performance, specialmente per le popolazioni cellulari più rare. Stiamo anche esplorando l’uso di approcci basati su reti neurali profonde (deep learning), che potrebbero essere ancora più potenti nel catturare le complesse relazioni nei dati ad alta dimensionalità.

In Conclusione

Decifrare la composizione cellulare del microambiente immunitario nei tessuti complessi e nei tumori è cruciale per capire la biologia della malattia e sviluppare terapie più efficaci. Con il nostro flusso di lavoro DOCexpress_fastqc + mySORT, speriamo di aver fornito uno strumento potente ma allo stesso tempo accessibile e intuitivo, che permette ai ricercatori di ottenere una visione più chiara e dettagliata di questo affascinante microcosmo, aprendo nuove strade per la medicina di precisione nell’immunoterapia oncologica.

Fonte: Springer