Decifrare il DNA senza codice: Quale software scegliere per l’analisi dell’esoma?

Ciao a tutti, appassionati di scienza e curiosi del genoma! Oggi vi porto con me in un’avventura affascinante nel cuore della genomica, un campo che sta rivoluzionando la medicina e la biologia. Avete mai sentito parlare di Whole-Exome Sequencing (WES)? È una tecnica potentissima che ci permette di leggere le parti più “succose” del nostro DNA, quelle chiamate esoni, che contengono le istruzioni per costruire le proteine. Capire cosa c’è scritto lì dentro è fondamentale, perché minuscole variazioni possono essere la chiave per comprendere malattie genetiche, predisposizioni e persino la risposta ai farmaci.

Ma c’è un “ma”. Analizzare i dati WES non è una passeggiata. Richiede strumenti bioinformatici complessi e, spesso, competenze di programmazione che non tutti possiedono, specialmente nei laboratori più piccoli o nelle cliniche. Qui entra in gioco la domanda cruciale: come fare se non si è dei maghi del codice?

La sfida del “Variant Calling”

Il cuore dell’analisi WES è il cosiddetto “variant calling”. Immaginate il genoma di riferimento come un libro standard. Il WES legge la vostra copia personale di quel libro (o almeno le parti codificanti) e il variant calling è il processo che identifica le differenze: parole scritte diversamente (Single Nucleotide Variants, SNV o SNP), parole aggiunte o mancanti (inserzioni/delezioni, o indels). Trovare queste varianti con precisione è vitale. Un errore qui potrebbe portare a diagnosi sbagliate o a perdere informazioni cruciali.

Tradizionalmente, questo compito spettava a software come GATK, BWA, Samtools, che richiedono una certa dimestichezza con la riga di comando e l’ambiente bioinformatico. Ma il panorama sta cambiando!

Arrivano i “Software Amichevoli”

Negli ultimi anni sono emersi software commerciali progettati proprio per chi non mastica codice H24. Promettono di fare il lavoro sporco del variant calling con interfacce grafiche intuitive, spesso basate sul web (Software-as-a-Service, SaaS) o installabili localmente. Niente più bisogno di computer potentissimi dedicati o di un bioinformatico a tempo pieno (o quasi!). Una vera manna dal cielo per molti laboratori e clinici.

Ma funzionano davvero bene? Sono accurati come i metodi tradizionali? E quale scegliere? È proprio qui che entra in gioco il mio racconto di oggi, basato su uno studio recente che ha messo alla prova quattro di questi “campioni” della genomica user-friendly.

I contendenti sul ring

Lo studio ha messo a confronto quattro pezzi da novanta del settore, selezionati proprio perché non richiedono competenze di programmazione:

• Illumina BaseSpace Sequence Hub (Illumina): Piattaforma web-based che utilizza il potente motore DRAGEN Enrichment.
• CLC Genomics Workbench (CLC): Software standalone (da installare sul PC) di Qiagen, con il suo modulo Lightspeed.
• Partek Flow (Partek): Piattaforma web-based flessibile, testata in due configurazioni: una con GATK e una combinando Freebayes e Samtools (F+S).
• Varsome Clinical (Varsome): Servizio web-based focalizzato sull’analisi clinica, che usa internamente strumenti come Sentieon (basato su GATK/BWA).

Questi quattro “gladiatori” digitali sono stati sfidati a analizzare tre set di dati WES “gold standard”.

L’arena: I dati “Gold Standard” GIAB

Per un confronto equo, non si possono usare dati qualsiasi. Serve un metro di paragone affidabile, una “verità” conosciuta. Qui entrano in gioco i dataset del Genome in a Bottle (GIAB) Consortium, in particolare HG001, HG002 e HG003. Si tratta di campioni umani il cui genoma è stato sequenziato e analizzato così a fondo, con così tante tecnologie diverse, da avere una lista di varianti considerate “vere” con altissima confidenza. È come dare a tutti i concorrenti lo stesso identico, difficilissimo puzzle di cui si conosce già la soluzione, per vedere chi lo ricompone meglio.

I dati sono stati allineati al genoma umano di riferimento (GRCh38) e poi ogni software ha fatto il suo lavoro: identificare SNV e indel. I risultati sono stati poi confrontati con le varianti “vere” dei dataset GIAB usando uno strumento apposito, il Variant Calling Assessment Tool (VCAT).

La resa dei conti: Accuratezza, Sensibilità e Velocità

E allora, chi ha vinto? I risultati parlano chiaro, soprattutto per quanto riguarda l’accuratezza (precisione: quante delle varianti chiamate sono vere?) e la capacità di trovare tutte le varianti presenti (sensibilità o recall: quante delle varianti vere sono state trovate?).

• Il campione dell’accuratezza: Illumina DRAGEN. Questo software ha sbaragliato la concorrenza, raggiungendo punteggi stratosferici sia per gli SNV (oltre il 99% sia in precisione che in recall) sia per gli indel (oltre il 96%). Ha anche trovato il maggior numero di varianti vere (True Positives, TP) in tutti e tre i campioni.
• Gli inseguitori: CLC, Partek (con GATK) e Varsome si sono comportati bene sugli SNV (precisione 96-98%, recall intorno al 98%), raggruppandosi abbastanza vicini. Sugli indel, le differenze erano maggiori, con Varsome e CLC che seguivano Illumina, e Partek (GATK) un po’ più indietro.
• La nota dolente (sugli indel): Partek (F+S). La combinazione di Freebayes e Samtools in Partek ha mostrato una performance significativamente inferiore nel chiamare gli indel, con una precisione media intorno al 60%, anche se sugli SNV era paragonabile agli altri inseguitori.
• Somiglianza: Nonostante le differenze, è interessante notare che la stragrande maggioranza (98-99%) delle varianti vere identificate erano comuni a tutti i software.

Ma l’accuratezza non è tutto. Quanto tempo ci mettono questi software a fare il loro lavoro, dal dato grezzo (FASTQ) al file con le varianti (VCF)?

• I velocisti: CLC e Illumina. CLC è risultato il più rapido, con tempi medi tra 6 e 26 minuti per campione. Illumina segue a ruota, tra 30 e 36 minuti. Tempi incredibilmente brevi!
• I maratoneti: Partek. Partek Flow ha richiesto decisamente più tempo. La versione F+S si attestava intorno alle 5 ore, mentre quella con GATK era la più lenta, superando le 16 ore in media! Varsome si posizionava a metà strada, intorno alle 2 ore.

Quindi, abbiamo un quadro: Illumina è il più accurato e tra i più veloci. CLC è il più veloce in assoluto con buone performance. Varsome e Partek (GATK) sono simili in accuratezza (tranne indel per Partek) ma con tempi diversi. Partek (F+S) soffre sugli indel e richiede comunque ore.

Oltre i numeri: L’analisi Terziaria e la Personalizzazione

Identificare le varianti (analisi secondaria) è solo metà del lavoro. Poi bisogna capire cosa significano: sono associate a malattie? Che effetto hanno sulla proteina? Questa è l’analisi terziaria. Come se la cavano i nostri contendenti qui?

• Illumina: Non offre strumenti integrati per l’analisi terziaria. Bisogna esportare il file VCF e usare altri software.
• CLC e Partek: Offrono funzionalità di base come l’annotazione di trascritti e proteine. Partek va oltre, integrando strumenti come VEP e SnpEff e permettendo l’annotazione da database come ClinVar, dbSNP, COSMIC. Partek offre anche molta flessibilità nella costruzione della pipeline di analisi secondaria.
• Varsome Clinical: Qui brilla particolarmente. Non solo offre annotazioni da una vasta gamma di database (ClinVar, ClinGen, COSMIC, dbSNP e molti altri), ma è progettato per la clinica e può persino classificare automaticamente la patogenicità delle varianti secondo le linee guida ACMG/AMP. L’analisi terziaria è integrata nel suo flusso “click-and-run”.

Questo aspetto è cruciale. Se l’obiettivo è l’interpretazione clinica, un software con forti capacità di analisi terziaria come Varsome può fare una grande differenza, anche se magari non è il primissimo della classe in termini di pura performance nel variant calling (pur essendo molto buono).

Cosa portarsi a casa?

Questo confronto è preziosissimo per chiunque si trovi a dover scegliere uno strumento per analizzare dati WES senza avere un background da bioinformatico. Cosa abbiamo imparato?

1. Non tutti i software “no-code” sono uguali: Illumina (DRAGEN) emerge come leader per accuratezza e velocità nell’analisi secondaria.
2. La velocità conta: CLC offre un’ottima combinazione di velocità e buona accuratezza.
3. L’analisi terziaria è fondamentale: Se l’interpretazione clinica è l’obiettivo, strumenti come Varsome offrono un valore aggiunto enorme. Partek offre un buon compromesso tra flessibilità e funzionalità.
4. Il compromesso è la chiave: La scelta dipende dalle priorità: massima accuratezza? Massima velocità? Funzionalità di interpretazione integrate? Flessibilità nella pipeline? Budget (i modelli di costo variano: abbonamenti annuali, costo per analisi, etc.)?
5. Accessibilità: Questi strumenti democratizzano l’analisi genomica, rendendola possibile anche per laboratori più piccoli, clinici e ricercatori in contesti con risorse limitate, senza la necessità di hardware costoso (molti sono cloud-based) o personale ultra-specializzato.

Un’ultima nota (di onestà)

Come ogni studio, anche questo ha i suoi limiti. È stato usato un solo tipo di kit di cattura dell’esoma (Agilent) e una piattaforma di sequenziamento (Illumina). I risultati potrebbero variare con altre tecnologie. Inoltre, sono stati usati solo tre campioni GIAB, e ci si è concentrati su SNV e piccoli indel, tralasciando varianti strutturali più complesse. Ma resta un punto di partenza solido e informativo.

In conclusione, l’era in cui l’analisi genomica era appannaggio esclusivo dei bioinformatici sta tramontando. Strumenti potenti e user-friendly sono disponibili, e scegliere quello giusto è ora una questione di bilanciare attentamente prestazioni, funzionalità e necessità specifiche. Spero che questo viaggio dietro le quinte del variant calling vi sia stato utile!

Fonte: Springer