CITK, il Regista Nascosto della Riparazione del DNA: Come Modula BRCA1 via HDAC6

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel cuore delle nostre cellule, per scoprire come meccanismi incredibilmente complessi lavorano per proteggere il nostro DNA. Parleremo di sviluppo cerebrale, di danni al DNA e di come una proteina un po’ misteriosa, chiamata CITK (Citron Kinase), giochi un ruolo da protagonista inaspettato.

Il Cervello in Crescita e la Sfida del DNA

Immaginate il cervello durante lo sviluppo: un cantiere frenetico dove le cellule progenitrici si moltiplicano a rotta di collo per generare la vasta gamma di neuroni di cui avremo bisogno. Questo processo è delicatissimo. Mantenere l’integrità del nostro genoma è cruciale, perché durante questa rapida proliferazione, le rotture del DNA, in particolare le temibili rotture del doppio filamento (DSBs), sono all’ordine del giorno. Se non riparate correttamente, queste rotture possono portare a mutazioni, riarrangiamenti cromosomici e persino alla morte cellulare. Un accumulo di DSBs è tossico, specialmente per le cellule progenitrici del cervello.

Esistono principalmente due modi per riparare le DSBs: la ricombinazione omologa (HR) e la giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ). La HR è particolarmente importante durante la replicazione del DNA (fasi S e G2 del ciclo cellulare) perché usa la cromatide sorella come stampo, garantendo una riparazione senza errori. Questo processo coinvolge una squadra di proteine specializzate, tra cui le famose BRCA1 e BRCA2, e la proteina RAD51, che si lega al DNA danneggiato per iniziare la riparazione.

Quando questi meccanismi di riparazione non funzionano a dovere, le conseguenze possono essere gravi, portando a disturbi neurologici severi. Un esempio lampante è la microcefalia, una condizione in cui la circonferenza della testa è significativamente ridotta. Molte forme di microcefalia ereditaria primaria (MCPH) sono causate da mutazioni in geni coinvolti proprio nella riparazione del DNA e nel mantenimento della stabilità genomica.

CITK: Un Gene, Tante Funzioni e un Legame con la Microcefalia

Uno di questi geni è CIT, che codifica per la proteina CITK. Varianti patogeniche di CIT causano la sindrome MCPH17. Sappiamo già da studi precedenti che la perdita di CITK porta all’accumulo di danni al DNA nel cervello in via di sviluppo, sia nei mammiferi che nella Drosophila. Inoltre, le cellule senza CITK sono più sensibili alle radiazioni ionizzanti e hanno problemi con la riparazione del DNA tramite HR, in particolare nel reclutare RAD51 sui siti danneggiati.

Ma CITK non si occupa solo di DNA. È fondamentale anche durante la mitosi, per completare correttamente la divisione cellulare (citochinesi) e per il posizionamento del corpo intermedio. Questi processi dipendono dalla capacità di CITK di promuovere la stabilità dei microtubuli, le impalcature dinamiche della cellula. Curiosamente, i microtubuli non sono importanti solo per la divisione cellulare, ma recenti scoperte suggeriscono un loro ruolo anche nel mantenimento del genoma durante l’interfase, la fase “normale” della vita cellulare. Sembra infatti che la stabilizzazione dei microtubuli sia necessaria per un’efficiente riparazione del DNA. C’è quindi un legame intrigante tra la dinamica dei microtubuli e la risposta al danno del DNA.

La Nostra Indagine: CITK e il Reclutamento di BRCA1

Visto che la perdita di CITK compromette il reclutamento di RAD51 senza alterare i livelli di un’altra proteina chiave (fosfo-RPA), ci siamo chiesti: forse CITK influenza anche la funzione di BRCA1? Per scoprirlo, abbiamo usato cellule di medulloblastoma ONS-76, che sapevamo essere sensibili alla perdita di CITK in termini di riparazione del DNA.

Abbiamo ridotto l’espressione di CITK usando la tecnica dell’RNA interference (RNAi) e poi abbiamo indotto danni al DNA con la Bleomicina. Già dopo 24 ore, le cellule senza CITK mostravano un accumulo di “foci” nucleari marcati con 53BP1 (un indicatore affidabile di DSBs), ma, sorprendentemente, un numero ridotto di foci di BRCA1. Anche l’intensità del segnale di BRCA1 che co-localizzava con 53BP1 era significativamente minore. In questa fase, i livelli totali di proteina BRCA1 e RAD51 non erano ancora cambiati significativamente.

Dopo 48 ore, l’effetto era ancora più marcato: più danni (foci 53BP1) e ancora meno BRCA1 sui siti danneggiati. A questo punto, però, abbiamo notato che anche i livelli totali di proteina e mRNA di BRCA1 e RAD51 erano diminuiti. Questo suggerisce che CITK è necessario per reclutare efficacemente BRCA1 sui siti di danno al DNA, e forse, più a lungo termine, anche per mantenerne i livelli complessivi.

Abbiamo verificato se questo effetto dipendesse dallo stato proliferativo delle cellule, dato che l’espressione delle proteine HR è legata al ciclo cellulare. Usando la marcatura con EdU per identificare le cellule in fase S (quelle che replicano il DNA), abbiamo visto che la riduzione dei foci di BRCA1 avveniva sia nelle cellule proliferanti (EdU-positive) che in quelle non proliferanti (EdU-negative), già a 24 ore, quando la proliferazione non era ancora alterata. Quindi, sembra che CITK sia necessario per mantenere i livelli basali di BRCA1 sui siti di danno, indipendentemente dalla proliferazione.

Questione di Struttura, Non Solo di Attività Enzimatica

Le mutazioni nel gene CIT che causano la MCPH17 possono essere di due tipi: alcune portano alla perdita completa della proteina (frameshift, FS), altre producono una proteina stabile ma con l’attività enzimatica (chinasica) inattivata (kinase inactive, KI). Per capire se fosse l’attività chinasica di CITK o la sua struttura a essere importante per BRCA1, abbiamo usato un modello fantastico: cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) con mutazioni CIT^FS/FS o CIT^KI/KI, differenziate in cellule progenitrici neurali (NPCs) e organoidi cerebrali.

I risultati sono stati chiari: le NPCs e gli organoidi CIT^FS/FS (senza proteina CITK) mostravano una riduzione dei foci di BRCA1 rispetto ai controlli. Invece, le cellule CIT^KI/KI (con proteina non attiva) non mostravano differenze significative rispetto ai loro controlli. Abbiamo confermato questo risultato anche in modelli murini: nel cervelletto di topi Cit^FS/FS i livelli di BRCA1 erano ridotti, mentre in quelli Cit^KI/KI erano normali. Questo ci dice una cosa importante: è la presenza strutturale di CITK, la sua funzione di “impalcatura” (scaffolding), più che la sua attività catalitica, a essere necessaria per regolare i livelli di BRCA1 durante lo sviluppo dei progenitori neurali.

Il Ponte tra CITK, Microtubuli e Riparazione del DNA: Entra in Scena HDAC6

Abbiamo visto che la perdita di CITK riduce la stabilità dei microtubuli (misurata come riduzione dell’acetilazione della tubulina alfa, ac-TUB). Poteva esserci un collegamento tra questo e i problemi di riparazione del DNA? Cercando partner di interazione di CITK in dati precedenti, abbiamo notato una proteina interessante: HDAC6 (Histone Deacetylase 6), insieme a CYLD, un enzima deubiquitinante.

HDAC6 è un personaggio affascinante con un doppio ruolo. Nel citoplasma, promuove l’instabilità dei microtubuli de-acetilando la tubulina alfa. Nel nucleo, invece, ha funzioni legate alla riparazione del DNA: è noto che HDAC6 può impedire il reclutamento di BRCA1 sui siti di danno. L’interazione con CYLD, che può inibire HDAC6, aggiunge un altro livello di complessità.

Abbiamo confermato con esperimenti di co-immunoprecipitazione che CITK interagisce effettivamente sia con CYLD che con HDAC6. Sembra che HDAC6 si leghi alla regione coiled-coil di CITK, mentre CYLD preferisca la regione C-terminale.

A questo punto, la domanda era: CITK regola i livelli o la localizzazione di HDAC6? Abbiamo scoperto che, mentre i livelli totali di HDAC6 non cambiano molto nelle cellule senza CITK, la sua quantità nel nucleo aumenta significativamente, mentre tende a diminuire nel citoplasma. Questo è un indizio cruciale! Se HDAC6 nucleare inibisce BRCA1, e la perdita di CITK aumenta HDAC6 nucleare, forse è proprio questo il meccanismo alla base dei difetti osservati.

La Prova del Nove: Agire su HDAC6 per Salvare la Situazione

Se la nostra ipotesi era corretta, ridurre HDAC6 nelle cellule senza CITK avrebbe dovuto migliorare le cose. E così è stato!

• Abbiamo ridotto HDAC6 con RNAi: questo ha aumentato l’acetilazione della tubulina (come previsto) e, soprattutto, ha riportato i livelli di BRCA1 e il numero di foci di BRCA1 e 53BP1 a livelli simili a quelli delle cellule di controllo, anche in assenza di CITK!
• Abbiamo usato un inibitore specifico di HDAC6, la Tubastatina A (TubA): anche a basse dosi, TubA ha aumentato l’acetilazione della tubulina, ridotto i livelli nucleari di HDAC6 e, cosa più importante, ha riportato il numero di foci di BRCA1 e 53BP1 verso la normalità nelle cellule senza CITK. Ha persino corretto i difetti di citochinesi!
• Abbiamo provato a stabilizzare direttamente i microtubuli con basse dosi di Paclitaxel: anche questo trattamento ha ridotto i livelli nucleari di HDAC6 e ha prevenuto l’aumento dei danni al DNA causato dalla perdita di CITK.

Al contrario, sovraesprimere HDAC6 ha ridotto i foci di BRCA1, confermando il suo ruolo inibitorio. Insomma, sembra proprio che l’asse CITK-HDAC6 sia fondamentale: CITK, forse tramite la sua interazione con CYLD e il suo effetto sui microtubuli, terrebbe sotto controllo i livelli nucleari di HDAC6, permettendo così a BRCA1 di fare il suo lavoro di riparazione.

Dalla Provetta all’Organismo: Il Modello Zebrafish Conferma Tutto

Ma queste scoperte fatte in cellule coltivate valgono anche in un organismo complesso? Per rispondere, abbiamo creato il primo modello di MCPH17 in zebrafish, un piccolo pesce tropicale molto usato nella ricerca biomedica. Abbiamo “spento” il gene omologo di CIT nello zebrafish (chiamato cita) usando diverse tecniche (morpholino, CRISPR-Cas9).

Il risultato? Gli embrioni senza la funzione di cita sviluppavano una chiara microcefalia, proprio come nei pazienti umani, confermando la conservazione evolutiva della funzione di CITK. La cosa ancora più emozionante è stata vedere che potevamo “curare” questa microcefalia!

• Esprimendo la proteina CITK di topo negli embrioni di zebrafish senza cita, la dimensione della testa tornava normale.
• Trattando gli embrioni microcefalici con l’inibitore di HDAC6, Tubastatina A, la dimensione della testa migliorava in modo dose-dipendente.
• Riducendo i livelli di Hdac6 nello zebrafish con un morpholino specifico, si otteneva lo stesso effetto di recupero della microcefalia.

Questi risultati in vivo sono potentissimi: dimostrano che l’asse CITK-HDAC6 è funzionalmente rilevante per lo sviluppo cerebrale e che agire su HDAC6 può effettivamente correggere il difetto fenotipico causato dalla perdita di CITK.

Conclusioni e Prospettive Future

Quindi, cosa abbiamo imparato? Abbiamo scoperto un nuovo meccanismo attraverso cui CITK contribuisce a mantenere l’integrità del genoma. Non agisce solo come chinasi, ma anche come una piattaforma strutturale che, interagendo forse con CYLD e influenzando la dinamica dei microtubuli, regola la quantità di HDAC6 nel nucleo. Questo, a sua volta, è cruciale per permettere a BRCA1 di raggiungere i siti di danno al DNA e avviare la riparazione.

Questa scoperta getta nuova luce sulla patogenesi della microcefalia MCPH17, mostrando come difetti in CITK possano intrecciare problemi nella divisione cellulare (legati ai microtubuli) e problemi nella riparazione del DNA (legati a HDAC6/BRCA1).

La cosa più entusiasmante è la prospettiva terapeutica. Identificare approcci per trattare disturbi dello sviluppo neurologico come la microcefalia è una sfida enorme. Il fatto che l’inibizione di HDAC6, sia farmacologica (con TubA) che genetica, riesca a correggere il fenotipo microcefalico nel modello zebrafish è un segnale molto promettente. Suggerisce che gli inibitori di HDAC6 potrebbero meritare ulteriori indagini come potenziale strategia terapeutica per la sindrome MCPH17. Certo, la strada è ancora lunga, ma aver identificato un bersaglio molecolare “trattabile” è un passo avanti significativo!

Spero che questo viaggio nel mondo della riparazione del DNA e della microcefalia vi sia piaciuto tanto quanto a me è piaciuto raccontarvelo!

Fonte: Springer