Smascherare i Farmaci Anti-Amiloide: Viaggio al Cuore dei Meccanismi d’Azione

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un’avventura scientifica affascinante, un po’ come fare i detective ma a livello molecolare. Parliamo di malattie neurodegenerative, come l’Alzheimer e il Parkinson. Sapete, quelle patologie terribili associate all’accumulo di proteine “dispettose”, le amiloidi, che formano aggregati dannosi nel nostro cervello. Da anni, la comunità scientifica si danna l’anima per trovare composti che possano contrastare questa aggregazione. Ma c’è un “ma” grande come una casa: spesso, anche quando un composto sembra funzionare, non capiamo bene *come* faccia il suo lavoro. È un po’ come avere una chiave che apre una porta, senza sapere esattamente quale meccanismo fa scattare dentro la serratura.

Il Problema: Capire “Come” Funzionano Davvero i Farmaci

Immaginate di setacciare migliaia di molecole. Alcune sembrano promettenti in provetta, magari rallentano la formazione di queste fibrille amiloidi. Altre mostrano effetti positivi in modelli cellulari, tipo riducendo la formazione di quegli ammassi proteici visibili al microscopio. Però, resta il mistero: il composto si lega direttamente alla proteina “malata”? E se sì, a quale sua forma? La proteina monomerica, cioè quella singola e ancora “innocua”? O le fibrille già formate? Oppure agisce in modo indiretto, magari influenzando altri attori cellulari?

Conoscere il meccanismo d’azione è fondamentale. Pensateci: se sappiamo esattamente dove e come un farmaco agisce, possiamo progettarne di migliori, più potenti, con meno effetti collaterali. Inoltre, le strutture delle fibrille che creiamo in laboratorio potrebbero non essere identiche a quelle che si formano nel cervello dei pazienti. E gli effetti che vediamo nelle cellule potrebbero essere dovuti a interazioni con proteine completamente diverse da quella che pensavamo fosse il bersaglio! C’era un bisogno disperato di un metodo per “ficcanasare” e capire cosa succede davvero, sia con le proteine purificate che, soprattutto, nel complesso ambiente di cellule e tessuti.

La Nostra Soluzione: Una “Lente d’Ingrandimento” Molecolare Chiamata LiP-MS

Ed è qui che entriamo in gioco noi! Abbiamo sviluppato un approccio, una sorta di “pipeline” di proteomica chimica, per andare a fondo nel meccanismo d’azione di questi composti anti-amiloidogenici. Il cuore di questo sistema è una versione potenziata di una tecnica chiamata LiP-MS (Limited Proteolysis-Mass Spectrometry).

Come funziona? È geniale nella sua semplicità. Immaginate di avere una proteina. Alcune sue parti sono più esposte e flessibili, altre più nascoste e rigide. Se usiamo delle “forbicine molecolari” (le proteasi), queste taglieranno più facilmente nelle zone esposte. Misurando i frammenti prodotti con uno spettrometro di massa (una specie di bilancia super precisa per molecole), otteniamo una sorta di “impronta digitale” della struttura della proteina. Se un composto si lega alla proteina, o ne cambia la forma, l’accessibilità delle proteasi cambierà, e quindi cambierà anche l’impronta digitale. Bingo! Possiamo capire dove il composto ha interagito.

La nostra versione “ad alta risoluzione” ci permette di individuare i siti di interazione quasi a livello del singolo amminoacido. E la cosa più bella è che possiamo usarla per:

• Vedere se un composto interagisce con forme specifiche della proteina (monomero o fibrilla) in vitro.
• Seguire come il composto influenza l’evoluzione strutturale della proteina nel tempo.
• Valutare le interazioni direttamente in estratti cellulari e tissutali, vedendo se il composto colpisce la proteina endogena e, importantissimo, se ha altri bersagli (i cosiddetti “off-targets”).

Mettiamolo alla Prova: L’Alfa-Sinucleina e i Suoi “Nemici”

Per testare il nostro sistema, abbiamo preso l’alfa-sinucleina, la proteina implicata nel Parkinson, e l’abbiamo messa di fronte a sei composti noti per le loro proprietà anti-amiloidogeniche (EGCG, Baicaleina, doxiciclina, Fasudil e due composti proprietari di AC Immune) più la Tioflavina T (ThT), una molecola che si lega alle amiloidi.

Inizialmente, abbiamo studiato cosa succedeva in vitro, cioè con proteine purificate. Abbiamo visto che i più potenti inibitori dell’aggregazione (EGCG, Baicaleina e il composto 2 di AC Immune) portavano l’alfa-sinucleina a formare strutture che non erano né monomeri né fibrille complete, forse un mix di stati intermedi. L’EGCG, per esempio, sembrava “compattare” il monomero di alfa-sinucleina interagendo con le sue estremità N- e C-terminale. La Baicaleina, invece, mostrava segni di legame covalente. Sorprendentemente, il Fasudil non sembrava avere effetti strutturali sull’alfa-sinucleina in nessuna delle sue forme, mentre la ThT interagiva con l’estremità N-terminale delle fibrille di alfa-sinucleina, ma solo debolmente con il “cuore” dell’aggregato.

Questi esperimenti in provetta ci hanno già dato un sacco di informazioni dettagliate. Ad esempio, abbiamo potuto mappare i siti di interazione e capire se i composti si legavano in modo covalente o meno, o se inducevano cambiamenti strutturali specifici. Per l’EGCG, abbiamo confermato che l’interazione con le estremità N- e C-terminale del monomero di alfa-sinucleina induce una compattazione della proteina. Quando abbiamo testato versioni troncate dell’alfa-sinucleina (senza queste estremità), l’EGCG era meno efficace nell’inibire l’aggregazione, a riprova del ruolo di queste regioni.

Per le fibrille, l’EGCG ha mostrato cambiamenti strutturali all’estremità N-terminale e nella parte C-terminale della regione NAC (il cuore dell’aggregazione), e anche qui c’erano segni di modifiche covalenti. La Baicaleina si comportava in modo simile. Il composto 2 di AC Immune, invece, pur essendo un potente inibitore, mostrava un pattern di interazione completamente diverso con le fibrille, toccando solo l’estremo N-terminale. La Doxiciclina causava cambiamenti strutturali nelle fibrille, soprattutto all’N-terminale. E la Tioflavina T? Anche lei, prevalentemente sull’N-terminale delle fibrille, con poche variazioni nel core amiloide, il che è interessante perché si pensa che la ThT si leghi proprio lì.

La Prova del Nove: Dentro le Cellule e nel Cervello

Ma la vera sfida, il “momento della verità”, è vedere cosa succede in situ, cioè in un contesto più fisiologico come un lisato cellulare o addirittura un estratto di cervello. Le strutture delle fibrille in vivo potrebbero essere diverse, e la presenza di migliaia di altre proteine potrebbe “distrarre” i nostri composti.

E qui sono arrivate le sorprese! Quando abbiamo testato EGCG, Baicaleina, doxiciclina e ThT su lisati di cellule di neuroblastoma che sovraesprimevano alfa-sinucleina, abbiamo visto che questi composti interagivano debolmente (o per niente) con l’alfa-sinucleina. In compenso, però, si legavano a una marea di altre proteine cellulari! L’EGCG e la Baicaleina, in particolare, sono risultati essere quelli che in gergo chiamiamo “PAIN compounds” (Pan-Assay Interference Compounds), molecole un po’ “promiscue” che tendono a legarsi a tante cose. Questo ci dice una cosa importantissima: gli effetti benefici visti in alcuni modelli cellulari potrebbero non dipendere dall’interazione diretta con l’alfa-sinucleina, ma da questi altri bersagli!

Abbiamo esteso l’analisi con l’EGCG a lisati di cervello umano post-mortem di pazienti con Parkinson. Anche qui, l’alfa-sinucleina rispondeva debolmente, mentre altre 2489 proteine mostravano cambiamenti strutturali! Usando un’analisi più stringente per identificare i bersagli con alta confidenza (LiPQuant), l’alfa-sinucleina non risultava un bersaglio significativo per nessuno di questi quattro composti nei lisati cellulari. L’EGCG, ad esempio, ha mostrato una predilezione per proteine che legano ATP, e i nostri dati hanno confermato che si lega proprio vicino a questi siti di legame.

E il composto 2 di AC Immune, quello che in vitro era un potente inibitore? Beh, lui è stato la star anche in situ! Abbiamo testato il composto 2 su lisati di neuroni primari di ratto (precedentemente “infettati” con semi di fibrille di alfa-sinucleina umana). Ebbene, l’alfa-sinucleina era tra le proteine che mostravano cambiamenti strutturali! Il peptide modificato mappava nella regione NAC, proprio come avevamo visto in vitro con il monomero di alfa-sinucleina purificato. Questo suggerisce che il composto 2 interagisce con l’alfa-sinucleina endogena, e probabilmente con la sua forma monomerica.

Non solo: abbiamo trattato neuroni vivi con il composto 2 e semi di alfa-sinucleina. Anche qui, LiP-MS ha identificato l’alfa-sinucleina come uno dei bersagli, con il cambiamento sempre nella regione NAC. E la cosa più entusiasmante è che il composto 2 ha mostrato effetti protettivi: migliorava la sopravvivenza neuronale, aumentava la lunghezza dei neuriti e riduceva i livelli di alfa-sinucleina. Insomma, un vero anti-amiloidogenico!

Perché Tutto Questo è Importante?

Questa pipeline che abbiamo sviluppato è, a mio modesto parere, un passo avanti gigantesco. Ci permette di:

• Capire se i composti interagiscono con diverse forme strutturali della proteina target.
• Identificare se si legano in modo covalente.
• Valutare l’interazione nel contesto cellulare, smascherando interazioni “off-target” e capendo se l’interazione con la proteina d’interesse avviene davvero.

Nel caso del composto 2, i nostri dati suggeriscono che si lega alla forma monomerica dell’alfa-sinucleina in situ, nella regione NAC, e questo ha effetti protettivi. Per composti come l’EGCG e la Baicaleina, invece, abbiamo capito che la loro azione in modelli cellulari è probabilmente dovuta a interazioni con altre proteine, non con l’alfa-sinucleina. Questo è cruciale per lo sviluppo di farmaci: non vogliamo inseguire falsi positivi!

Un’ultima nota sull’EGCG: data la sua promiscuità e i potenziali effetti avversi a dosi elevate, i nostri dati suggeriscono cautela nell’uso di alte dosi di EGCG, come quelle presenti in alcuni integratori alimentari, senza supervisione medica.

Il nostro approccio apre la strada a screening di farmaci (e anche di traccianti diagnostici come quelli per la PET) direttamente in lisati di cervello, mirando a strutture proteiche rilevanti dal punto di vista fisiologico e patologico. Immaginate di trovare un composto che si lega selettivamente alla forma patologica dell’alfa-sinucleina nel cervello di pazienti Parkinson, ma non interagisce con nulla in individui sani. Sarebbe una svolta!

È un lavoro complesso, ma ogni piccolo passo avanti nella comprensione di queste malattie ci avvicina a terapie più efficaci. E poter “vedere” come i farmaci agiscono a livello molecolare è come accendere una luce in una stanza buia. Spero di avervi trasmesso un po’ della passione che mettiamo in questa ricerca!

Fonte: Springer