Superbatteri Sotto Scacco: La Mia Caccia Digitale a Nuovi Farmaci Contro le Infezioni Resistenti!

Amici scienziati e curiosi di scoperte, mettetevi comodi perché oggi vi racconto un’avventura che mi ha tenuto con il fiato sospeso, un viaggio tra il mondo virtuale dei computer e quello, molto reale, delle provette di laboratorio. Il nemico? Un batterio dal nome un po’ ostico, Stenotrophomonas maltophilia, un vero osso duro che sta dando parecchio filo da torcere negli ospedali di tutto il mondo. Il problema principale è che questo microrganismo è diventato un campione di resistenza agli antibiotici, rendendo le infezioni che causa difficilissime da curare.

Il Problema: Un Batterio Corazzato

Avete presente gli antibiotici β-lattamici? Sono tra le nostre armi più preziose contro le infezioni batteriche. Ecco, S. maltophilia ha sviluppato degli “scudi” super efficaci contro di loro: degli enzimi chiamati β-lattamasi, in particolare uno chiamato L1 Metallo-β-lattamasi (MBL). Questo enzima, come un abile demolitore, neutralizza gli antibiotici prima che possano fare il loro lavoro. Immaginate la frustrazione: abbiamo le armi, ma il nemico le disinnesca! In India, ad esempio, la situazione è drammatica, con migliaia di neonati che muoiono ogni anno per sepsi causate da batteri resistenti. E S. maltophilia è uno dei protagonisti di questo triste scenario, soprattutto nelle infezioni nosocomiali, quelle che si prendono in ospedale, colonizzando cateteri e altri dispositivi medici.

La L1 β-lattamasi è particolarmente insidiosa perché utilizza due ioni zinco (Zn²⁺) nel suo sito attivo per “masticare” gli antibiotici. E il guaio è che, al momento, non abbiamo inibitori clinicamente approvati specifici per queste metallo-β-lattamasi. Gli inibitori che funzionano contro altre β-lattamasi, come l’acido clavulanico, qui fanno cilecca. Urgeva trovare qualcosa di nuovo!

La Strategia: Detective Digitali e Provette

Cosa fare, dunque? Arrendersi? Giammai! Ho pensato: e se usassimo la potenza dei computer per setacciare un’enorme libreria di composti chimici alla ricerca di un potenziale “sabotatore” per questo enzima L1? È qui che entra in gioco il cosiddetto Computer-Aided Drug Design (CADD), e in particolare una tecnica chiamata virtual High Throughput Screening (vHTS). In pratica, è come avere un super-detective digitale che esamina milioni di “sospetti” (le molecole) per vedere quali potrebbero incastrarsi perfettamente nel sito attivo dell’enzima L1, bloccandolo.

Ho preso un database chiamato ZINC15, che contiene le informazioni strutturali di una miriade di composti. Ne ho scaricati circa 500.000! Un numero enorme, impensabile da testare uno per uno in laboratorio. Per prima cosa, li ho filtrati in base ad alcune proprietà chimico-fisiche desiderabili per un farmaco (peso molecolare, solubilità, ecc.). Poi, usando un software chiamato AutoDock Vina, ho simulato l’aggancio (docking) di ciascuna di queste molecole alla struttura tridimensionale dell’enzima L1 (ottenuta dal Protein Data Bank, con codice 6UAF). L’obiettivo era trovare quelle molecole che si legassero all’enzima con la maggiore affinità, misurata da un punteggio chiamato energia di legame (più è negativo, meglio è).

Dopo questa prima, massiccia scrematura, sono emersi 37 composti promettenti, con energie di legame che andavano da -8.1 kcal/mol a -7.2 kcal/mol. Mica male! Ma non è finita qui. Un buon farmaco non deve solo legarsi bene al bersaglio, ma deve anche essere “gestibile” dal nostro corpo: deve essere assorbito, distribuito, metabolizzato ed escreto correttamente, e soprattutto non deve essere tossico. Questa fase si chiama analisi ADMET (Assorbimento, Distribuzione, Metabolismo, Escrezione, Tossicità). Ho usato strumenti online come SWISS-ADME e ADMETsar per valutare queste proprietà, scartando anche i composti che potevano dare falsi positivi nei test (i cosiddetti PAINS).

Alla fine di questo processo di selezione, due candidati si sono distinti particolarmente: ZINC393032 (un nome un po’ tecnico, lo so, il suo nome comune è Benzo[j]fenantridin-12-olo) e ZINC616394. Entrambi sembravano avere le carte in regola: buona affinità di legame, buone proprietà farmacocinetiche, non tossici (almeno secondo le previsioni) e, cosa cruciale, interagivano con gli ioni zinco nel sito attivo dell’enzima.

La Prova del Nove: Simulazioni Dinamiche

Avere due “finalisti” era già un ottimo risultato, ma volevo essere ancora più sicuro. Così, ho sottoposto i complessi formati dall’enzima L1 e da ciascuno di questi due composti a simulazioni di dinamica molecolare (MD) per ben 300 nanosecondi. Immaginate di fare un filmato super dettagliato di come queste molecole interagiscono nel tempo, come si muovono, quanto è stabile il loro legame. Ho usato un software chiamato GROMACS per questo. Analizzando parametri come RMSD (Root Mean Square Deviation, che misura la stabilità conformazionale) e RMSF (Root Mean Square Fluctuation, che indica la flessibilità delle singole parti della proteina), oltre al numero di legami idrogeno formati, è emerso che ZINC393032 formava un complesso più stabile e promettente con l’enzima L1 rispetto a ZINC616394. L’energia libera di legame calcolata con il metodo MM/PBSA ha confermato questa superiorità per ZINC393032 (-68.02 kJ/mol contro -52.23 kJ/mol per ZINC616394). Sembrava proprio lui il nostro campione!

Dal Virtuale al Reale: I Test in Laboratorio

Tutto molto bello sulla carta (o meglio, sullo schermo del computer), ma la vera sfida era vedere se ZINC393032 funzionasse anche nel mondo reale, in provetta. Era il momento della validazione in vitro.
Per prima cosa, ho dovuto produrre l’enzima L1 ricombinante in laboratorio, purificandolo. Poi, ho testato l’attività inibitoria di ZINC393032. Ho usato un substrato colorato, la nitrocefina, che diventa rosa scuro quando viene idrolizzata dall’enzima. Aggiungendo il nostro ZINC393032, ho osservato che l’intensità del colore rosa diminuiva, segno che l’enzima veniva inibito! Ho calcolato la IC50, cioè la concentrazione di inibitore necessaria per dimezzare l’attività dell’enzima: per ZINC393032 è risultata essere 22.96 µM. Come controllo positivo ho usato l’EDTA, un noto inibitore delle metallo-β-lattamasi, che ha mostrato una IC50 di 2.24 µM. Il nostro composto era meno potente dell’EDTA, ma comunque efficace.

Ma inibire l’enzima isolato è una cosa, fermare la crescita del batterio intero è un’altra. Ho quindi determinato la Concentrazione Minima Inibente (MIC) di ZINC393032 contro S. maltophilia, che è risultata essere 15.6 µg/ml. Per darvi un’idea, l’imipenem, un antibiotico β-lattamico che dovrebbe funzionare, aveva una MIC di 250 µg/ml contro questo ceppo, indicando una forte resistenza.

L’Unione Fa la Forza: Sinergia con gli Antibiotici

La vera svolta, però, è arrivata quando ho provato a combinare il nostro ZINC393032 con l’imipenem. L’idea era: se ZINC393032 blocca l’enzima L1, forse l’imipenem può tornare a fare il suo lavoro? Ho usato un metodo chiamato “checkerboard synergy assay” e… bingo! Ho trovato diverse combinazioni dei due composti che mostravano un effetto sinergico, cioè l’effetto combinato era maggiore della somma dei singoli effetti. In pratica, insieme riuscivano a inibire il batterio a concentrazioni molto più basse di quelle necessarie se usati da soli. L’indice FIC (Fractional Inhibitory Concentration), che misura la sinergia, era ≤ 0.5, confermando l’ottima collaborazione tra i due.

Per finire, ho condotto studi “time-kill”, monitorando la sopravvivenza dei batteri nel tempo in presenza di queste combinazioni sinergiche. I risultati sono stati entusiasmanti: le combinazioni di ZINC393032 e imipenem non solo fermavano la crescita dei batteri, ma li uccidevano attivamente (effetto battericida), e non si osservava ricrescita batterica dopo 24 ore. In particolare, le combinazioni con la concentrazione più alta del nostro inibitore (3.9 µg/ml di ZINC393032 con 31.25 µg/ml o 15.3 µg/ml di imipenem) erano le più efficaci.

Conclusioni e Prospettive Future

Cosa ci dice tutto questo? Che la combinazione di approcci computazionali e sperimentali è una strategia potentissima per scoprire nuovi farmaci. Partendo da mezzo milione di molecole, siamo riusciti a identificarne una, il Benzo[j]fenantridin-12-olo (ZINC393032), che non solo inibisce l’enzima L1 β-lattamasi di S. maltophilia, ma, cosa ancora più importante, quando usata in combinazione con un antibiotico β-lattamico come l’imipenem, mostra un promettente effetto battericida. È interessante notare che, per quanto ne so, non c’erano studi precedenti sull’attività biologica di questo specifico composto, anche se suoi derivati hanno mostrato attività antibatterica e antivirale.

Certo, la strada per arrivare a un nuovo farmaco utilizzabile sui pazienti è ancora lunga e piena di ostacoli. Serviranno ulteriori studi per ottimizzare questo composto, valutarne la sicurezza in modelli più complessi e, infine, testarlo clinicamente. Anche l’altro candidato, ZINC616394, meriterebbe forse una chance nei test in vitro, visto che anche lui sembrava interagire bene con entrambi gli ioni zinco.
Ma questo studio, a mio avviso, getta le basi per future strategie mirate a contrastare la resistenza mediata dalle β-lattamasi in questo batterio così problematico. È un piccolo passo, ma spero significativo, nella lotta contro i superbatteri. E per me, è stata un’avventura affascinante, che dimostra come la curiosità e la perseveranza, armate degli strumenti giusti, possano davvero aprire nuove frontiere nella medicina.

Fonte: Springer