Batteri Intelligenti: Come Abbiamo Insegnato a Bacillus subtilis a Produrre Molta Più Vitamina K2!

La Vitamina K2: Un Tesoro Nascosto e la Sfida della Produzione

Avete mai sentito parlare della Vitamina K2, in particolare della forma chiamata menachinone-7 (MK-7)? È una specie di superstar silenziosa nel mondo della salute. Studi recenti la collegano a un sacco di benefici: aiuta a prevenire problemi cardiovascolari e osteoporosi, e sembra promettente anche contro malattie come Alzheimer, Parkinson e persino alcuni tipi di cancro. Con l’invecchiamento della popolazione globale, capite bene che trovare modi per avere più MK-7 diventa cruciale, sia per la prevenzione che come potenziale terapia.

Il problema? Produrla in grandi quantità non è proprio una passeggiata. Uno dei modi migliori è usare un batterio, il Bacillus subtilis. Questo microrganismo è considerato sicuro (ha lo status GRAS, “Generalmente Riconosciuto come Sicuro”) e si presta bene alle modifiche genetiche, un po’ come un telaio su cui costruire. Conosciamo abbastanza bene il percorso che porta alla sintesi di MK-7 dentro di lui.

Tuttavia, la strada per produrre MK-7 è lunga e tortuosa, con molte “vie secondarie” (le chiamiamo vie metaboliche di bypass) che competono per le stesse materie prime. Queste vie producono altre cose, come amminoacidi (fenilalanina, tirosina, triptofano) o acido folico, che sono sì importanti per la crescita del batterio, ma “rubano” risorse alla produzione di MK-7.

Il Dilemma: Crescita o Produzione?

Qualcuno ha provato a risolvere il problema semplicemente “chiudendo” queste vie secondarie, eliminando i geni responsabili. Ad esempio, bloccando la produzione di alcuni sottoprodotti si è visto un piccolo aumento di MK-7. Ma c’è un grosso “ma”: queste vie secondarie, pur essendo competitive, producono sostanze essenziali per la crescita del batterio stesso. Quindi, se le blocchi completamente, il batterio cresce male e, alla fine, produce comunque poco MK-7. Un bel dilemma: favorire la crescita o la produzione? Sembrava un gioco a somma zero.

Qui entra in gioco l’idea geniale: e se potessimo controllare queste vie secondarie in modo dinamico? Cioè, lasciarle funzionare normalmente quando il batterio deve crescere e poi “abbassare il volume” quando è ora di concentrarsi sulla produzione di MK-7?

L’Interruttore Molecolare: Il Quorum Sensing al Salvataggio

Abbiamo pensato di usare un meccanismo naturale che i batteri usano per “parlare” tra loro e capire quanti sono: il quorum sensing (QS). In pratica, quando i batteri raggiungono una certa densità (cioè sono tanti), iniziano a produrre segnali chimici che attivano o disattivano certi geni. È un sistema di regolazione dinamica perfetto: si attiva da solo quando la popolazione batterica è alta, proprio quando vogliamo spingere sulla produzione di MK-7, e non richiede l’aggiunta di costosi induttori chimici dall’esterno.

Nello specifico, ci siamo concentrati su un sistema QS presente in B. subtilis chiamato PhrC-RapC-SinR. Funziona più o meno così:

• I batteri producono un piccolo segnale (PhrC) che si accumula all’esterno.
• Quando ce n’è tanto, entra nella cellula e blocca una proteina chiamata RapC.
• Normalmente, RapC tiene a bada un’altra proteina, SinR (che è un repressore, cioè spegne i geni).
• Quindi, quando PhrC blocca RapC, SinR è libera di agire e spegnere i geni a cui si lega.

SinR è interessante perché regola la formazione di biofilm, un processo che abbiamo visto essere collegato alla produzione di MK-7, e si lega a specifiche sequenze di DNA per bloccare la trascrizione. L’idea era: e se mettessimo queste sequenze “bersaglio” di SinR davanti ai geni delle vie secondarie che vogliamo silenziare?

Costruire e Ottimizzare l’Interruttore

Il primo passo è stato capire quali geni fossero effettivamente controllati da SinR e trovare i “punti di aggancio” (promotori) su cui agisce meglio. Abbiamo usato una tecnica con una proteina fluorescente verde (eGFP): più verde vedevamo, più il promotore era attivo. Inducendo SinR, abbiamo visto quali promotori si “spegnevano”. Il promotore del gene epsA (chiamato PepsA) si è rivelato particolarmente sensibile a SinR.

Ma non ci siamo fermati qui. Abbiamo “giocato” con la sequenza del promotore PepsA, modificando i siti di legame per SinR e altre regioni importanti, per renderlo ancora più reattivo e ottenere uno spegnimento più forte. Dopo vari tentativi, abbiamo creato una versione ottimizzata (chiamata Pe9) che veniva repressa da SinR molto più efficacemente dell’originale (quasi l’80% in più di repressione!).

Poi abbiamo verificato che l’intero sistema PhrC-RapC-SinR funzionasse come previsto con il nostro promotore ingegnerizzato Pe9. Abbiamo costruito ceppi batterici in cui potevamo controllare RapC e PhrC e abbiamo visto che:

• Esprimere RapC da solo diminuiva l’attività del promotore Pe9 (perché RapC inibisce SinR, che quindi non può reprimere Pe9).
• Esprimere sia PhrC che RapC ripristinava la repressione del promotore Pe9 quando la densità batterica aumentava. A bassa densità, il promotore era attivo; ad alta densità (sopra un OD600 di circa 10), PhrC si accumulava, liberava SinR e il nostro promotore Pe9 veniva spento. Bingo! Avevamo il nostro interruttore dinamico che rispondeva alla densità cellulare.

Mettere l’Interruttore al Lavoro per MK-7

Ora veniva il bello: usare questo interruttore per controllare le famose vie secondarie. Abbiamo preso i geni chiave di queste vie (*aroA*, *aroH*, *trpE*, *dhbB*, e l’operone *alsS-alsD*) e abbiamo sostituito i loro promotori originali con le nostre versioni ingegnerizzate sensibili a SinR (abbiamo usato diverse varianti, come Pe11, Pe9 e Pe17, a seconda del gene, per bilanciare finemente l’effetto).

L’obiettivo era chiaro: durante la fase iniziale di crescita, quando la densità è bassa, SinR è inattivo e questi geni vengono espressi normalmente, permettendo al batterio di crescere bene. Man mano che i batteri si moltiplicano, il sistema QS si attiva, SinR entra in gioco e inizia a reprimere l’espressione di questi geni. In questo modo, le preziose risorse metaboliche vengono reindirizzate verso la via principale di sintesi dell’MK-7, proprio quando serve di più.

Il Risultato? Un Successo Strepitoso!

E i risultati? Davvero entusiasmanti! Il ceppo finale ingegnerizzato (chiamato BW7), con tutte le modifiche e l’interruttore dinamico PhrC-RapC-SinR al suo posto, ha prodotto 87.52 mg/L di MK-7. Partivamo da 13.95 mg/L nel ceppo originale: è un aumento di ben 6.27 volte!

La cosa ancora più bella è che questo incredibile aumento di produzione è stato ottenuto senza sacrificare la crescita batterica; anzi, il ceppo ingegnerizzato cresceva leggermente meglio e manteneva la fase produttiva più a lungo. Abbiamo dimostrato che è possibile bilanciare crescita e produzione usando un approccio di regolazione dinamica intelligente.

Conclusioni e Prospettive Future

Questo lavoro dimostra la potenza dell’ingegneria metabolica dinamica guidata dal quorum sensing. Abbiamo creato un interruttore molecolare sofisticato che permette a Bacillus subtilis di ottimizzare autonomamente la produzione di un metabolita prezioso come l’MK-7.

Questo approccio non solo apre la strada a una produzione industriale più efficiente di Vitamina K2, ma rappresenta anche una strategia versatile che potrebbe essere applicata per migliorare la sintesi di molti altri composti utili in diversi microrganismi. È un esempio affascinante di come possiamo “dialogare” con i batteri e sfruttare i loro stessi meccanismi di regolazione per scopi biotecnologici. Il futuro della produzione basata sui microbi sembra davvero brillante!

Fonte: Springer