Identificare l’Influenza in un Lampo: Ecco il Barcode a RNA Specifico!

Ah, l’influenza! Quel fastidioso compagno stagionale che conosciamo fin troppo bene. Ma sapete qual è una delle sfide più grandi nel combatterla? Il virus dell’influenza (IV) è un vero trasformista! Muta continuamente, creando nuovi ceppi che causano reinfezioni su scala globale. Questo rende la prevenzione e il controllo una corsa continua contro il tempo.

La Sfida dell’Identificazione Virale

Identificare rapidamente e accuratamente quale tipo di virus influenzale sta circolando è fondamentale per la salute pubblica. Pensateci: abbiamo quattro tipi principali, IAV, IVB, ICV e IDV. L’IAV, in particolare, è quello che tiene tutti sulle spine per la sua vasta gamma di ospiti e la sua capacità di evolversi rapidamente. Tutti e quattro sono virus a RNA a singolo filamento negativo, con genomi segmentati, il che significa che possono “rimescolare le carte” genetiche abbastanza facilmente, portando a nuovi sottotipi.

Ogni anno, l’Organizzazione Mondiale della Sanità stima circa 1 miliardo di casi di influenza nel mondo, con 3-5 milioni di casi gravi e tra 290.000 e 650.000 decessi. Numeri impressionanti che sottolineano l’urgenza di avere strumenti diagnostici efficaci.

Le tecniche tradizionali come la RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) o l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) sono considerate affidabili, certo. La RT-PCR è spesso vista come il “gold standard”. Ma hanno i loro limiti: richiedono attrezzature sofisticate, personale specializzato, tempo e, diciamocelo, un investimento economico non indifferente. Immaginate di doverle implementare su larga scala, magari in zone con risorse limitate o durante un’emergenza pandemica. I costi per singolo test, la necessità di una catena del freddo per i reagenti, la complessità operativa… tutto si somma.

Una Soluzione Innovativa: Il Barcoding Genetico

Ed è qui che entra in gioco un’idea affascinante: il barcoding genetico. Introdotta da Paul Hebert nel 2003, inizialmente per la biodiversità, questa tecnologia usa brevi sequenze di DNA o RNA, uniche e stabili per una specie, come dei veri e propri “codici a barre” molecolari. Sfruttando le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS), possiamo identificare le specie in modo efficiente, accurato e, soprattutto, su larga scala.

Vi chiederete: “Ma non è costoso anche l’NGS?”. L’investimento iniziale per le piattaforme di sequenziamento può essere significativo, è vero. Ma il bello è che il costo per campione diminuisce drasticamente all’aumentare del numero di campioni analizzati simultaneamente. Quando si processano centinaia o migliaia di campioni, l’NGS diventa molto più conveniente della RT-PCR. Inoltre, richiede meno tempo manuale rispetto all’ELISA (grazie all’automazione) e non dipende strettamente dalla catena del freddo, rendendola più pratica in contesti difficili. Insomma, una soluzione più scalabile e accessibile.

Negli ultimi anni, abbiamo visto il barcoding applicato con successo all’identificazione di virus, come nel caso dei coronavirus legati al SARS-CoV-2 nei pangolini o nello studio dei virus a RNA negli insetti Ceratopogonidi.

Il Nostro Progetto: Barcode a RNA per l’Influenza

Basandoci su queste esperienze positive, ci siamo chiesti: possiamo creare un sistema di barcoding a RNA specifico per i quattro tipi di virus influenzali? L’obiettivo era ambizioso: trovare dei segmenti di RNA “firma”, unici per ciascun tipo di influenza (IAV, IVB, ICV, IDV), e verificare la loro accuratezza, affidabilità e capacità di generalizzazione nell’identificare questi virus in campioni biologici non noti.

Come abbiamo fatto? Abbiamo costruito un “training set” (TRS) con sequenze genomiche complete dei quattro tipi di virus, raccolte da diverse regioni del mondo per assicurarci una buona rappresentatività. Abbiamo analizzato le differenze genetiche (polimorfismi a singolo nucleotide – SNP), calcolato le distanze genetiche (GEDI) e costruito alberi filogenetici per capire le relazioni tra i vari tipi.

Abbiamo usato strumenti bioinformatici come DnaSP e BLAST per scovare e selezionare i segmenti di RNA candidati a diventare i nostri “barcode”. Dovevano essere regioni altamente conservate all’interno di un tipo di virus, ma sufficientemente diverse dagli altri tipi.

I Risultati: Le “Impronte Digitali” dell’Influenza

E i risultati sono stati entusiasmanti! Abbiamo identificato:

• 7 segmenti barcode per l’Influenza A (IAV)
• 29 segmenti barcode per l’Influenza B (IBV)
• 40 segmenti barcode per l’Influenza C (ICV)
• 5 segmenti barcode per l’Influenza D (IDV)

In totale, 81 barcode a RNA specie-specifici. Abbiamo anche sviluppato un punteggio, il BSW (Barcode Segment Weight), che combina i risultati di BLAST e l’analisi di conservazione per valutare l’efficienza identificativa di ciascun barcode. Abbiamo notato che i barcode per IAV e ICV avevano punteggi BSW mediamente più alti, suggerendo una maggiore capacità identificativa in ambienti complessi, come nelle analisi metagenomiche.

Rendere i Barcode Accessibili: Codici 1D/2D e un Database Online

Ma a cosa servono dei barcode fantastici se non sono facili da usare? Abbiamo pensato anche a questo. Ogni barcode è stato visualizzato come una combinazione di codice a barre 1D (simile a quelli che vedete sui prodotti, ma rappresentando le basi azotate AT/GC) e un codice 2D (tipo QR code). Questi codici 2D sono “dinamici”: scansionandoli con un dispositivo mobile, si accede non solo alla sequenza del barcode, ma anche a informazioni aggiornate.

E per raccogliere tutto questo? Abbiamo creato il FluBarDB (Influenza Virus Barcode Database), un database online accessibile a tutti (http://virusbarcodedatabase.top/database/index.html). Qui i ricercatori possono scaricare i barcode, usare strumenti di analisi come BLAST per confrontare le loro sequenze con il nostro database, visualizzare i dati e persino calcolare tassi di richiamo e specificità. È una risorsa pensata per facilitare la collaborazione e accelerare la ricerca.

La Prova del Nove: Testare l’Efficacia dei Barcode

Ovviamente, dovevamo essere sicuri che questi barcode funzionassero davvero sul campo. Abbiamo creato diversi set di dati di test (TES).
Con TES-2, abbiamo valutato il “tasso di richiamo” (recall rate), cioè la capacità dei barcode di identificare correttamente le sequenze del loro tipo specifico di influenza, anche quelle non presenti nel nostro training set originale. Il risultato? Un impressionante tasso di richiamo medio a livello nucleotidico del 96.86%! Per l’IBV abbiamo superato addirittura il 99.39%. Questo significa che anche di fronte a varianti nuove o sequenze con qualche imperfezione, i nostri barcode sono estremamente affidabili.

Con TES-3, abbiamo testato la “specificità”, ovvero la capacità di non identificare erroneamente virus di tipo diverso o specie correlate. La specificità media a livello nucleotidico è stata del 55.27%. Può sembrare un valore non altissimo, ma indica che c’è più del 50% di differenza a livello di sequenza tra i diversi tipi di influenza e specie correlate, permettendo una distinzione chiara, specialmente aggiustando le soglie di analisi. A livello di specie, tutti i barcode hanno identificato correttamente il loro target.

Infine, con TES-4, abbiamo messo alla prova la capacità di generalizzazione usando database esterni enormi (come GISAID per SARS-CoV-2, BV-BRC per batteri e virus, NGDC per altri virus come Poxviridae e Monkeypox, e RVDB). I risultati? Precisione del 100% e tasso di falsa omissione (FOR) dello 0%. I nostri barcode influenzali hanno identificato solo l’influenza, senza confondersi con altri patogeni, anche quelli di grande rilevanza sanitaria attuale.

Cosa Significa Tutto Questo?

Questa ricerca dimostra che la tecnologia di barcoding a RNA è uno strumento potente ed efficace per l’identificazione rapida e accurata dei quattro tipi di virus influenzali. Rispetto a lavori precedenti (come quelli sul SARS-CoV-2), i nostri barcode per l’influenza mostrano prestazioni migliorate in termini di richiamo e specificità.

L’uso innovativo dei codici 1D/2D e la creazione del database FluBarDB rendono questa tecnologia più interattiva, accessibile e facile da usare, anche per chi non è un esperto di bioinformatica. Questo approccio supera molti limiti dei metodi tradizionali, specialmente in termini di costi su larga scala, velocità e applicabilità in contesti con risorse limitate.

L’analisi genetica che abbiamo condotto (SNP, GEDI, filogenesi, flusso genico) ci ha anche permesso di capire meglio la diversità genetica e l’evoluzione di questi virus. Ad esempio, abbiamo visto che l’IAV ha una maggiore differenziazione interna e sembra scambiare materiale genetico più facilmente, mentre ICV e IDV appaiono più “isolati” evolutivamente.

Guardando al Futuro

Certo, c’è sempre spazio per migliorare. Una limitazione del nostro studio è non aver esplorato a fondo come i fattori dell’ospite (cioè noi, o altri animali) possano influenzare le prestazioni dei barcode. La ricerca futura si concentrerà proprio su questo: studiare le interazioni ospite-virus e il loro impatto sull’efficacia dei barcode, oltre a esplorare l’uso di altri strumenti bioinformatici per ampliare ulteriormente le applicazioni di questa tecnologia nel monitoraggio dei patogeni e negli studi sulla biodiversità.

In conclusione, abbiamo sviluppato e validato un sistema di barcoding a RNA robusto e accessibile per l’influenza. Speriamo che questo lavoro non solo migliori la nostra comprensione della genetica e dell’evoluzione di questi virus, ma fornisca anche nuovi strumenti concreti per la sorveglianza epidemiologica e la risposta rapida alle minacce virali, contribuendo alla salute pubblica globale.

Fonte: Springer