Il Ballo Segreto di Xist e Tsix: Come la Stocasticità Rivela i Molteplici Volti della Regolazione Genica

Avete presente quel cassetto pieno di oggetti di cui non capite bene l’utilità, ma che sapete essere importanti? Ecco, per anni, una grossa fetta del nostro genoma è stata un po’ così. Parlo dei geni non codificanti, in particolare dei lunghi RNA non codificanti (lncRNA). Per un sacco di tempo li abbiamo considerati “rumore di fondo” della cellula, ma stiamo scoprendo che sono dei veri e propri direttori d’orchestra nella fisiologia e, ahimè, anche nelle malattie. Il problema? Per la maggior parte di loro, non abbiamo la più pallida idea di come facciano il loro lavoro.

Nel mio laboratorio, ci siamo tuffati a capofitto in questo mistero, concentrandoci su una coppia di lncRNA particolarmente intrigante: Xist e il suo “gemello” antisenso, Tsix. Questi due sono cruciali per un processo affascinante chiamato Inattivazione del Cromosoma X (XCI), un meccanismo che nelle femmine dei mammiferi “spegne” uno dei due cromosomi X per bilanciare l’espressione genica con i maschi. Se l’XCI va storto, possono insorgere problemi seri, come tumori o disturbi dell’umore. Nonostante Xist e Tsix siano tra gli lncRNA più studiati, c’era ancora un gran guazzabuglio di ipotesi su come Tsix regolasse Xist, a volte persino contraddittorie.

Smascherare i meccanismi: una questione di metodo

Capire come funzionano questi lncRNA è un bel rompicapo. Molti studi si basano su misurazioni fatte su intere popolazioni di cellule, che però non ci dicono cosa succede nella singola cellula. È un po’ come cercare di capire le dinamiche di una folla ascoltando solo il brusio generale. Altri studi usano mutazioni per indagare, ma queste possono avere effetti imprevisti, un po’ come cercare di riparare un orologio con un martello! Noi abbiamo deciso di cambiare approccio.

Abbiamo usato tecniche di microscopia ad altissima risoluzione, come la smRNA-FISH (single-molecule RNA Fluorescent In-Situ Hybridization), che ci permette di “fotografare” e contare le singole molecole di RNA direttamente dentro le cellule, una per una, e senza doverle modificare geneticamente. Ci siamo concentrati su cellule staminali embrionali di topo femmina, un sistema perfetto per osservare la regolazione di Xist nelle sue fasi iniziali. La vera svolta è stata sfruttare la stocasticità trascrizionale, cioè la naturale variabilità nell’espressione genica tra cellula e cellula. Invece di vederla come un “difetto”, l’abbiamo usata come una lente d’ingrandimento per capire quali meccanismi entrano in gioco a diversi livelli di attività trascrizionale.

Ipotesi al vaglio: cosa non succede tra Xist e Tsix

C’erano diverse idee sul tavolo. Una, per esempio, suggeriva che Tsix potesse legarsi direttamente a Xist. Immaginate due filamenti di RNA che si appaiano come una cerniera. Questo legame potrebbe innescare la degradazione di Xist (un meccanismo chiamato RNA interference, o RNAi) oppure mascherare una regione critica di Xist, impedendole di funzionare. Per verificare, abbiamo usato sonde fluorescenti specifiche per le porzioni di Xist e Tsix che non dovrebbero appaiarsi, così da poterle vedere anche se fossero legate. Ebbene, sorpresa! Le molecole di Xist e Tsix mature, quelle già processate e pronte all’uso, se ne andavano per i fatti loro nella cellula, quasi ignorandosi. La loro co-localizzazione era minima, quasi casuale. Questo ci ha portato a escludere, con buona probabilità, che l’RNAi o il mascheramento diretto del trascritto siano i meccanismi principali con cui Tsix regola Xist.

Un’altra ipotesi era che Tsix potesse agire “a distanza” (in trans), magari reclutando proteine regolatrici che poi andassero a silenziare Xist in tutta la cellula. Se fosse così, dovremmo vedere una correlazione negativa: tante molecole di Tsix in giro, poche di Xist. Abbiamo contato meticolosamente le molecole di entrambi nelle singole cellule e, ancora una volta, i dati non supportavano questa idea. Non c’era una correlazione significativa a livello dell’intera cellula. Sembrava proprio che la regolazione non avvenisse in questo modo diffuso.

L’azione è locale: la regolazione in cis

Se non è in trans, allora forse è in cis, cioè l’azione di Tsix avviene localmente, sullo stesso cromosoma da cui viene trascritto, influenzando Xist “da vicino”. E qui le cose si sono fatte interessanti. Osservando i siti di trascrizione attivi – quei punti nel nucleo dove l’RNA polimerasi sta lavorando alacremente per produrre nuove molecole di RNA – abbiamo notato una forte correlazione negativa tra la quantità di Xist nascente e quella di Tsix nascente. In pratica, quando uno era molto attivo, l’altro tendeva ad esserlo meno, e viceversa, proprio lì, sul posto. Questo era un chiaro segnale che la regolazione avveniva proprio durante l’atto della trascrizione.

Ma come? Due meccanismi principali basati sulla trascrizione erano stati proposti:

• Interferenza Trascrizionale (TI): Immaginate due treni che corrono su binari convergenti. Se le RNA polimerasi che trascrivono Xist e Tsix (che sono orientati in direzioni opposte e si sovrappongono parzialmente) si scontrano, la trascrizione può interrompersi prematuramente. Un vero e proprio “ingorgo” molecolare.
• Modificazione della Cromatina: L’atto stesso della trascrizione può reclutare enzimi che modificano la cromatina, la struttura che impacchetta il DNA. Una di queste modifiche è la trimetilazione della lisina 36 sull’istone H3 (H3K36me3), un “marchio” che può influenzare l’espressione genica. Era stato suggerito che la trascrizione di Tsix potesse depositare questo marchio per reprimere Xist.

La stocasticità svela un doppio gioco: TI e modifiche alla cromatina

Qui entra in gioco la bellezza della stocasticità. Analizzando cellule con diversi livelli di trascrizione nascente, abbiamo scoperto che non c’è un solo meccanismo all’opera, ma almeno due, e dipendono da quanto “traffico” c’è sul DNA!

Quando la trascrizione è alle stelle (livelli alti): Abbiamo osservato che l’Interferenza Trascrizionale (TI) diventa protagonista. Se ci sono tantissime polimerasi che cercano di trascrivere Xist o Tsix contemporaneamente nelle regioni sovrapposte, è più probabile che si scontrino, limitando l’espressione dell’uno o dell’altro. Questo effetto era particolarmente evidente nelle regioni di sovrapposizione tra i due geni.

Quando la trascrizione è a livelli medi: Qui la situazione cambia. A questi livelli, Xist e Tsix possono essere co-trascritti, cioè le polimerasi riescono a “convivere” meglio. E indovinate un po’? È proprio a questi livelli medi di co-trascrizione che abbiamo visto il maggior accumulo della modificazione istonica H3K36me3 vicino ai siti di trascrizione. I nostri dati, combinando smRNA-FISH con immunofluorescenza per H3K36me3, hanno mostrato che la trascrizione di Tsix è associata al deposito di H3K36me3, e che alti livelli di questo marchio sono correlati a una minore espressione di Xist. Sembra quindi che, a livelli medi, la trascrizione di Tsix “prepari il terreno” depositando H3K36me3, che a sua volta contribuisce a tenere a bada Xist.

È affascinante pensare che la stessa regione del genoma possa utilizzare strategie regolatorie diverse a seconda di quanto intensamente sta lavorando. La variabilità non è solo “rumore”, ma una caratteristica funzionale che permette una regolazione più fine e complessa.

Cosa ci insegna il ballo di Xist e Tsix?

Il nostro studio, quindi, dipinge un quadro più sfumato e dinamico della regolazione mediata dagli lncRNA. Non c’è una singola “bacchetta magica”, ma un insieme di strumenti che la cellula usa a seconda delle necessità. Nel caso di Xist e Tsix, abbiamo visto che:

• Meccanismi basati sul legame diretto tra i trascritti maturi o sulla regolazione in trans sembrano improbabili.
• La regolazione avviene in cis, localmente, durante la trascrizione.
• A livelli trascrizionali medi, la co-trascrizione di Xist e Tsix favorisce il deposito della modificazione istonica H3K36me3, che reprime Xist.
• A livelli trascrizionali alti, l’Interferenza Trascrizionale diventa il meccanismo dominante per l’inibizione reciproca.

Queste scoperte hanno implicazioni importanti. Innanzitutto, ci dicono che per capire davvero gli lncRNA, dobbiamo studiarli nel loro contesto nativo, a livello di singola cellula, e tenere conto della loro espressione variabile. Inoltre, se pensiamo a future terapie che mirano agli lncRNA (ad esempio, per trattare malattie in cui sono disregolati), dobbiamo considerare che potrebbero essere in gioco meccanismi multipli. Inibire un lncRNA potrebbe eliminare un meccanismo (come la TI ad alti livelli di espressione), ma lasciarne intatto un altro che funziona a livelli più bassi (come la modificazione della cromatina). Forse, un approccio combinato che colpisca più meccanismi potrebbe essere la chiave per studi futuri e per lo sviluppo di terapie più efficaci.

Il mondo degli lncRNA è ancora pieno di segreti, ma ogni studio come questo ci avvicina un po’ di più a comprenderne l’incredibile complessità e il ruolo fondamentale nella vita delle nostre cellule. E chissà quali altri “balli” molecolari aspettano solo di essere scoperti!

Fonte: Springer