ATR: Il Guardiano Segreto della “Super Giovinezza” nelle Cellule Staminali Umane

Ciao a tutti, appassionati di scienza! Oggi voglio parlarvi di qualcosa di veramente affascinante che sta succedendo nel mondo delle cellule staminali umane, quelle cellule incredibili che hanno il potenziale per diventare qualsiasi tipo di cellula del nostro corpo. Immaginatele come delle cellule “bambine”, piene di possibilità.

Esistono diversi stadi di “giovinezza” per queste cellule. Quelle che usiamo di solito in laboratorio, chiamate cellule staminali embrionali umane (hESC), sono in uno stato detto “primed” (che potremmo tradurre come “pronte” o “innescate”), simile a quello delle cellule presenti nell’embrione subito dopo l’impianto nell’utero. Ma c’è uno stato ancora più “giovane”, più fondamentale, chiamato “naïve” (ingenuo, primitivo), che assomiglia di più alle cellule dell’embrione primordiale, prima ancora dell’impianto. Queste cellule naïve sono considerate ancora più potenti, più versatili, un po’ come il “Santo Graal” della pluripotenza.

Ma come si passa da uno stato all’altro? E cosa mantiene le cellule nello stato naïve? Qui entra in gioco una proteina superstar, un vero e proprio direttore d’orchestra della pluripotenza: OCT4. Sappiamo che OCT4 è cruciale, ma il suo ruolo specifico nello stato naïve umano era ancora un mistero. Fino ad ora!

La Caccia alle Modifiche Nascoste su OCT4

Nel nostro laboratorio, ci siamo messi all’opera per svelare questo mistero. L’idea era: forse OCT4 non è sempre uguale? Forse subisce delle piccole modifiche chimiche che ne cambiano il comportamento a seconda che la cellula sia nello stato primed o naïve? Una delle modifiche più comuni e importanti nelle cellule è la fosforilazione: l’aggiunta di un piccolo gruppo fosfato a una proteina, come un interruttore che ne accende o spegne una funzione.

Per “vedere” queste modifiche su OCT4, abbiamo usato tecniche all’avanguardia. Prima abbiamo modificato geneticamente le nostre cellule staminali (usando la famosa tecnica CRISPR/Cas9) per aggiungere una sorta di “etichetta” (chiamata TAP-tag) alla proteina OCT4 endogena. Questo ci ha permesso di “pescare” selettivamente OCT4 dal frullato di proteine cellulari. Poi, abbiamo analizzato le proteine OCT4 isolate con uno strumento super potente, la spettrometria di massa (LC-MS/MS), che ci permette di identificare esattamente dove sono stati aggiunti i gruppi fosfato.

Scoperta Sorprendente: Firme Uniche per lo Stato Naïve

E qui è arrivata la sorpresa! Confrontando OCT4 dalle cellule primed e naïve, abbiamo scoperto delle differenze nette. C’erano siti di fosforilazione presenti in entrambi gli stati, altri presenti solo nello stato primed, ma soprattutto… abbiamo identificato due siti specifici (S136 e S180) che venivano fosforilati esclusivamente nelle cellule naïve! Era come se OCT4 avesse una “firma” di fosforilazione unica per lo stato di massima giovinezza. In particolare, il sito S180 non era mai stato documentato prima in letteratura!

Chi è il “Pittore” dei Fosfati? Ecco ATR!

Ok, abbiamo trovato la firma, ma chi è l’artista? Chi è l’enzima (la chinasi, nel gergo tecnico) che aggiunge quei gruppi fosfato proprio lì, solo nelle cellule naïve? Per scoprirlo, abbiamo usato dei programmi bioinformatici predittivi (come PhosphoNET e Scansite) e un algoritmo di machine learning chiamato IKAP, applicato ai dati globali di fosforilazione delle cellule (fosfoproteomica).

Incrociando i dati, un nome è emerso con forza: ATR. Ora, ATR è una chinasi molto nota, ma solitamente per un altro ruolo: è uno dei principali sensori del danno al DNA e dello stress replicativo. Quando il DNA si rompe o la sua duplicazione va in tilt, ATR si attiva e dà l’allarme, coordinando le riparazioni. Che ci faceva qui, a regolare la pluripotenza naïve?

Abbiamo subito verificato: misurando l’attività di ATR nelle due popolazioni cellulari, abbiamo confermato che i livelli di ATR attiva erano significativamente più alti nelle cellule naïve rispetto a quelle primed. Sembrava proprio che ATR fosse più “impegnata” nello stato di massima pluripotenza.

ATR: Non Solo Riparatore, Ma Guardiano della Pluripotenza Naïve

A questo punto, la domanda era cruciale: questa maggiore attività di ATR nelle cellule naïve è solo una coincidenza o è davvero importante per mantenere quello stato? Per rispondere, abbiamo fatto un esperimento chiave: abbiamo preso delle cellule primed e abbiamo provato a convertirle nello stato naïve, ma questa volta in presenza di un inibitore specifico di ATR (AZ20).

I risultati sono stati netti. Bloccare ATR rendeva molto più difficile la transizione allo stato naïve. Le cellule facevano fatica ad acquisire la morfologia tipica (quelle belle colonie a cupola) e non riuscivano ad attivare i geni marcatori dello stato naïve. Insomma, ATR sembrava essenziale per raggiungere e mantenere la pluripotenza naïve.

Ma non è finita qui. Abbiamo pensato al ruolo “classico” di ATR come protettore del DNA. Forse le cellule naïve, con più ATR attiva, erano anche più brave a difendersi dai danni? Abbiamo esposto sia cellule primed che naïve a stress che danneggiano il DNA (raggi UV e un farmaco chiamato camptotecina, CPT). Come previsto, le cellule naïve, senza trattamento aggiuntivo, mostravano meno segni di danno grave (meno γH2AX, un marcatore di rotture del DNA) e sopravvivevano meglio rispetto alle cellule primed.

E cosa succedeva bloccando ATR con l’inibitore AZ20? Le cellule naïve diventavano molto più vulnerabili! Il danno al DNA non veniva riparato efficacemente e, cosa più importante, aumentava drasticamente la loro morte cellulare programmata (apoptosi). Al contrario, nelle cellule primed, l’inibitore di ATR aveva un effetto meno drammatico sulla sopravvivenza. Questo ci dice che le cellule naïve dipendono fortemente da ATR per sopravvivere, specialmente quando il loro DNA è sotto attacco.

Un Legame Inaspettato tra Danno al DNA e Identità Cellulare

Per confermare che ATR potesse effettivamente “dipingere” quei gruppi fosfato su OCT4, abbiamo fatto anche esperimenti in provetta (in vitro). Abbiamo purificato la proteina OCT4 (sia normale che mutata nei siti S136 e S180) e l’abbiamo messa a contatto con estratti cellulari di cellule naïve, con o senza l’inibitore di ATR. I risultati hanno confermato che ATR è in grado di fosforilare OCT4, e che il sito S180 è il bersaglio principale, mentre S136 è un bersaglio secondario.

Quindi, mettendo insieme tutti i pezzi:

• Le cellule staminali naïve hanno una “firma” di fosforilazione unica su OCT4 (S136, S180).
• La chinasi ATR, nota per la risposta al danno del DNA, è più attiva nelle cellule naïve.
• ATR è responsabile (soprattutto per S180) di questa fosforilazione specifica.
• Bloccare ATR impedisce alle cellule di diventare naïve e le rende più vulnerabili ai danni al DNA.

Questo dipinge un quadro nuovo e affascinante: ATR, il guardiano del genoma, sembra avere un doppio lavoro nelle cellule staminali naïve. Non solo le protegge dai danni, ma, attraverso la fosforilazione di OCT4, contribuisce attivamente a mantenere il loro stato di “super giovinezza” e potenzialità. È come se la capacità di gestire lo stress del DNA fosse intrinsecamente legata alla capacità di rimanere in uno stato così fondamentale e versatile.

Cosa Significa Tutto Questo?

Questa scoperta apre scenari interessanti. Capire a fondo come ATR regola OCT4 e la pluripotenza naïve potrebbe aiutarci a:

• Sviluppare metodi più efficienti e sicuri per coltivare cellule staminali naïve in laboratorio.
• Comprendere meglio i meccanismi che garantiscono la stabilità del genoma nelle primissime fasi dello sviluppo embrionale.
• Potenzialmente, migliorare le strategie di medicina rigenerativa che utilizzano cellule staminali.

Certo, c’è ancora molto da esplorare. Ad esempio, come esattamente la fosforilazione di OCT4 da parte di ATR ne modifica la funzione? Quali altri attori sono coinvolti in questo dialogo tra risposta al danno e pluripotenza? Sono domande a cui cercheremo di rispondere con le prossime ricerche.

Per ora, abbiamo aggiunto un tassello importante: ATR non è solo un meccanico che ripara il DNA rotto, ma sembra essere anche un custode fondamentale dell’identità più profonda delle nostre cellule più potenti. Una scoperta che ci ricorda quanto siano complessi e interconnessi i meccanismi che governano la vita a livello cellulare!

Fonte: Springer