Astragalus e i Supereroi WRKY: Cronache di Resistenza alla Siccità!

Ciao a tutti, appassionati di scienza e meraviglie della natura! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel mondo microscopico delle piante, alla scoperta di veri e propri supereroi molecolari che le aiutano a sopravvivere in condizioni difficili. Parleremo di una pianta speciale, l’Astragalus membranaceus, e di una famiglia di geni chiamati WRKY, che giocano un ruolo da protagonisti nella sua lotta contro la siccità. Pronti a scoprire i segreti di questa incredibile resilienza?

Quando il gioco si fa duro: le piante e lo stress

Sapete, le piante non hanno vita facile. Sono costantemente esposte a un sacco di sfide ambientali: siccità, temperature estreme, terreni salini, per non parlare di parassiti e malattie. Tutti questi fattori, che noi scienziati chiamiamo “stress abiotici e biotici”, possono seriamente compromettere la loro crescita e, di conseguenza, la resa dei raccolti. Ma le piante, nel corso di milioni di anni di evoluzione, hanno sviluppato meccanismi di difesa sofisticatissimi. Al centro di questi meccanismi ci sono i fattori di trascrizione (TF), delle proteine speciali che agiscono come interruttori, accendendo o spegnendo specifici geni in risposta agli stimoli esterni. Tra questi, la famiglia dei TF WRKY è una delle più importanti e studiate.

L’Astragalus membranaceus: una star della medicina tradizionale sotto esame

L’Astragalus membranaceus, forse lo conoscete, è un’erba perenne famosissima nella medicina tradizionale, soprattutto quella cinese, per le sue mille virtù: si dice che rinforzi il “qi” (l’energia vitale), aiuti contro la sudorazione eccessiva, riduca gli edemi e potenzi il sistema immunitario. Insomma, una vera forza della natura! Però, anche questa pianta robusta sta soffrendo a causa dei cambiamenti climatici, della crescente salinità dei suoli e del degrado ecologico. La siccità, in particolare, mette a dura prova la sua coltivazione, influenzando negativamente la crescita e la produzione di flavonoidi, composti importantissimi per le sue proprietà benefiche. Capire come l’Astragalus si adatta e tollera la mancanza d’acqua è quindi cruciale. Ed è qui che entrano in gioco i nostri eroi, i geni WRKY! Fino ad ora, però, nessuno aveva fatto un’indagine completa su questi geni nell’Astragalus. E così, ci siamo messi al lavoro!

A caccia dei geni WRKY: un’indagine genomica

Immaginate di avere l’intera mappa genetica dell’Astragalus membranaceus (il suo genoma) e di dover trovare tutti i membri di una specifica famiglia di geni, i WRKY. È un po’ come cercare degli individui con un cognome specifico in un enorme elenco telefonico! Abbiamo usato potenti strumenti bioinformatici per scandagliare il genoma. Abbiamo cercato delle sequenze “firma”, come il dominio conservato “WRKYGQK” (una sequenza di sette amminoacidi) e una struttura chiamata “dito di zinco”, che sono i marchi di fabbrica dei geni WRKY. Dopo un’accurata analisi, abbiamo identificato ben 76 membri della famiglia WRKY nell’Astragalus, che abbiamo chiamato da AmWRKY1 a AmWRKY76. Questi geni non sono distribuiti a caso sui cromosomi della pianta, ma si trovano in numero variabile: il cromosoma 1 ne ospita ben 15, mentre il cromosoma 8 solo due. Curioso, vero?

Abbiamo poi analizzato le caratteristiche di queste 76 proteine WRKY: la più lunga è AmWRKY69 con 757 amminoacidi, la più corta AmWRKY17 con 164. I loro pesi molecolari variano, e la maggior parte di esse (quasi il 60%) ha una natura acida. E dove lavorano queste proteine? Le previsioni ci dicono che quasi tutte (74 su 76) operano nel nucleo della cellula, il centro di comando genetico. Solo AmWRKY39 sembra preferire la membrana plasmatica e AmWRKY63 i cloroplasti.

Classificazione e struttura: mettere ordine nella famiglia WRKY

Per capire meglio le relazioni tra i diversi AmWRKY e le loro possibili funzioni, li abbiamo confrontati con i geni WRKY di un’altra pianta modello, l’Arabidopsis thaliana. Questa analisi filogenetica ci ha permesso di dividere i 76 AmWRKY in tre gruppi principali:

• Gruppo I: 14 membri
• Gruppo II: 52 membri (il più numeroso!)
• Gruppo III: 10 membri

Il Gruppo II è stato ulteriormente suddiviso in cinque sottogruppi (IIa, IIb, IIc, IId, IIe). È interessante notare che nell’Astragalus il Gruppo II è particolarmente espanso rispetto all’Arabidopsis, suggerendo che questi specifici geni potrebbero aver subito eventi di duplicazione durante l’evoluzione di questa pianta.

Abbiamo anche guardato da vicino la loro struttura. La maggior parte delle proteine AmWRKY presenta il motivo conservato “WRKYGQK”, ma ci sono delle eccezioni con piccole variazioni, come “WRKYGKK” in alcuni membri del gruppo IIc. Queste variazioni potrebbero influenzare il modo in cui le proteine legano il DNA e quindi la loro funzione specifica. Anche la struttura a “dito di zinco” è generalmente presente, soprattutto di tipo “C2H2”, mentre il Gruppo III ha esclusivamente il tipo “C2HC”. Analizzando la struttura dei geni (esoni e introni), abbiamo visto che tutti gli AmWRKY hanno sia esoni (parti codificanti) che introni (parti non codificanti), con un numero variabile da 1 a 6 esoni e da 1 a 5 introni.

L’evoluzione dei geni WRKY e i loro interruttori

Come si è evoluta e ampliata questa famiglia di geni? Un meccanismo chiave è la duplicazione genica. Abbiamo trovato 41 eventi di duplicazione tra i geni AmWRKY: 37 duplicazioni segmentali (quando un grosso pezzo di cromosoma viene duplicato) e 4 duplicazioni tandem (geni duplicati uno accanto all’altro sullo stesso cromosoma). Le duplicazioni segmentali sembrano essere state la forza trainante principale nell’espansione di questa famiglia nell’Astragalus. Confrontando i geni WRKY dell’Astragalus con quelli di altre piante come mais, riso, Arabidopsis e Medicago truncatula, abbiamo visto che l’Astragalus è evolutivamente più vicino ad Arabidopsis e Medicago.

Poi, siamo andati a curiosare nelle regioni promotrici dei geni AmWRKY. I promotori sono come degli interruttori che controllano quando e quanto un gene deve essere attivato. Abbiamo trovato diversi elementi regolatori sensibili a ormoni vegetali (come giberelline, auxine, acido abscissico, metil jasmonato, acido salicilico) e a stress (come siccità, basse temperature, difesa). Questo ci dice che i geni WRKY sono profondamente coinvolti nella risposta della pianta a una vasta gamma di segnali interni ed esterni. Ad esempio, ben 41 geni AmWRKY contengono elementi sensibili alla siccità!

I geni WRKY sotto stress da siccità: chi si attiva?

Ed eccoci al dunque: come reagiscono i geni WRKY quando l’Astragalus ha sete? Per scoprirlo, abbiamo sottoposto le piante a stress da siccità (usando una soluzione di PEG6000 per simulare la mancanza d’acqua) e abbiamo analizzato l’espressione dei loro geni a diversi intervalli di tempo (0, 6, 12, 24 e 72 ore) usando tecniche di trascrittomica (RNA-seq) e qRT-PCR.
I risultati sono stati illuminanti! L’espressione di molti geni WRKY cambiava significativamente sotto stress. Già dopo 6 ore di trattamento, più di un terzo dei geni analizzati mostrava un aumento dell’espressione. In particolare, geni come AmWRKY8, AmWRKY22, AmWRKY39, e AmWRKY69 si sono “accesi” in modo notevole. Questo suggerisce che questi geni sono tra i primi a rispondere alla siccità, attivando le difese della pianta.

L’analisi GO (Gene Ontology) e KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) sui geni che cambiavano espressione ci ha confermato che sono principalmente coinvolti nella regolazione della trascrizione, nel legame al DNA e si trovano nel nucleo. Le vie metaboliche più arricchite erano quelle dell’interazione pianta-patogeno e della segnalazione MAPK, entrambe cruciali nelle risposte a stress biotici e abiotici. Insomma, i geni WRKY sono davvero al centro della rete di risposta allo stress!

Focus su AmWRKY8: un potenziale campione di resilienza

Tra i tanti, il gene AmWRKY8 ha attirato la nostra attenzione. La sua espressione aumentava significativamente sotto siccità, raggiungendo un picco dopo 6 ore (quasi 6 volte rispetto al controllo, come confermato dalla qRT-PCR). Ma cosa fa esattamente AmWRKY8?
Per capirlo meglio, abbiamo condotto ulteriori esperimenti. Prima di tutto, abbiamo verificato che la proteina AmWRKY8 è in grado di attivare la trascrizione di altri geni. Lo abbiamo fatto inserendo il gene in cellule di lievito: quelle con AmWRKY8 riuscivano ad attivare dei geni reporter, quelle senza no. Bingo!
Poi, abbiamo voluto vedere dove si localizza la proteina AmWRKY8 all’interno delle cellule vegetali. Usando una proteina fluorescente verde (GFP) legata ad AmWRKY8, abbiamo osservato al microscopio confocale che la fluorescenza era confinata esclusivamente nel nucleo delle cellule di tabacco. Questo conferma le previsioni bioinformatiche e il suo ruolo di fattore di trascrizione.

Infine, ci siamo chiesti con chi “parla” AmWRKY8, ovvero con quali altre proteine interagisce. Basandoci sul suo omologo in Arabidopsis (AtWRKY15), abbiamo predetto una rete di interazioni. Sembra che AmWRKY8 possa interagire con proteine chiave coinvolte nella segnalazione ormonale (come AtWRKY70, un regolatore multifunzionale, e ERF6), nello stress mitocondriale (NAC017) e nei processi di sviluppo (HBI1). Questo suggerisce che AmWRKY8 coordina la risposta alla siccità agendo su più fronti, integrando segnali di stress con lo sviluppo della pianta.

Cosa ci insegna questa ricerca?

Questo studio ci ha permesso di identificare e caratterizzare per la prima volta l’intera famiglia dei geni WRKY nell’Astragalus membranaceus. Abbiamo scoperto che sono 76, con strutture e localizzazioni tipiche di questi fattori di trascrizione, e che la loro evoluzione è stata guidata principalmente da duplicazioni geniche. Soprattutto, abbiamo visto che molti di loro, e in particolare AmWRKY8, si attivano rapidamente in risposta alla siccità. AmWRKY8, con la sua localizzazione nucleare e la sua capacità di attivare altri geni, sembra essere un attore chiave nel orchestrare la resistenza alla siccità, probabilmente modulando le vie di segnalazione ormonale.

Certo, c’è ancora molto da scoprire. Ad esempio, non abbiamo identificato il dominio preciso di AmWRKY8 che attiva la trascrizione, e la localizzazione nucleare andrebbe confermata con marcatori specifici. Ma i risultati ottenuti sono un passo avanti importantissimo! Forniscono informazioni fondamentali per future ricerche volte a capire ancora più a fondo i meccanismi molecolari della risposta allo stress nell’Astragalus e, perché no, per sviluppare in futuro varietà di questa preziosa pianta medicinale più resistenti alla siccità, aiutando così la sua coltivazione in un mondo che cambia.

È incredibile pensare a quanta complessità e ingegnosità si nasconda dentro una singola cellula vegetale, vero? La natura non smette mai di stupirci!

Fonte: Springer