Vericiguat Sotto la Lente: L’Analisi si Fa Eco-Chic con l’Eritrosina B!

Ciao a tutti, appassionati di scienza e non solo! Oggi voglio parlarvi di una cosa che mi ha davvero entusiasmato, un piccolo “colpo di genio” che unisce l’utile al dilettevole, o meglio, l’efficace all’ecologico nel campo dell’analisi farmaceutica. Sto parlando di come un comune colorante alimentare, l’eritrosina B, possa diventare uno strumento super potente per analizzare un farmaco importante come il vericiguat. E la parte migliore? Lo fa in modo “verde”, rispettando l’ambiente!

Ma cos’è il Vericiguat e perché ci interessa analizzarlo?

Allora, partiamo dalle basi. Il vericiguat, che magari conoscete con il nome commerciale Verquvo®, è un farmaco piuttosto innovativo. È uno stimolatore della guanilato ciclasi solubile (sGC) e viene utilizzato per trattare alcune patologie cardiache. In pratica, aiuta a rilassare i vasi sanguigni e a migliorare l’efficienza con cui il cuore pompa il sangue. Mica male, eh? Come potete immaginare, quando si ha a che fare con farmaci così specifici, è fondamentale poterli analizzare con precisione, sia nella loro forma pura che nelle compresse che arrivano ai pazienti. Questo serve per garantirne la qualità, la sicurezza e l’efficacia.

La letteratura scientifica ci dice che il vericiguat è stato studiato con diverse tecniche analitiche, come la cromatografia (HPLC, UPLC-MS/MS) e metodi spettrofotometrici. Ma c’è sempre spazio per migliorare, per trovare metodi più rapidi, semplici, sensibili e, perché no, più ecologici.

L’Eroina Inaspettata: l’Eritrosina B

Ed è qui che entra in gioco la nostra protagonista: l’eritrosina B (EB). Probabilmente l’avete già incontrata senza saperlo: è un colorante alimentare rosso (quello della famiglia delle xantine, per i più tecnici) usato anche in cosmetici e farmaci. Ma l’EB non è solo bella da vedere! Ha delle proprietà davvero interessanti: è economica, facilmente reperibile, molto sensibile e, udite udite, ha persino dimostrato attività antivirale contro virus come Zika e Dengue. Dal punto di vista chimico, è un colorante acido, e questa sua caratteristica è la chiave di tutto.

L’idea geniale è stata quella di sfruttare la capacità dell’eritrosina B di reagire con farmaci che contengono gruppi amminici basici, come il nostro vericiguat. Questa reazione porta alla formazione di un cosiddetto “complesso di coppia ionica”. Immaginate un po’ come due calamite di segno opposto che si attraggono: l’EB “acida” e il vericiguat “basico” si legano, e questo legame cambia le proprietà ottiche della soluzione. E noi, da bravi detective scientifici, possiamo misurare questi cambiamenti!

Due Metodi al Prezzo di Uno (o quasi!): Spettrofotometria e Spettrofluorimetria

I ricercatori hanno messo a punto ben due metodi, entrambi basati su questa interazione tra vericiguat ed eritrosina B, che avviene in modo ottimale a un pH di 4 (ottenuto con un tampone chiamato Britton-Robinson, un classico dei laboratori).

Il primo metodo è spettrofluorimetrico. L’eritrosina B, di per sé, è fluorescente: se la eccitiamo con una luce a 530 nm, emette luce a 550 nm. Quando però si lega al vericiguat, questa sua fluorescenza nativa diminuisce, si “spegne” (in gergo tecnico si parla di quenching). Misurando quanto si spegne la fluorescenza, possiamo risalire alla quantità di vericiguat presente. Questo metodo si è rivelato incredibilmente sensibile, con un limite di rilevamento (LOD) di soli 0.036 µg/mL e un limite di quantificazione (LOQ) di 0.110 µg/mL. Funziona alla grande per concentrazioni di vericiguat tra 0.05 e 0.5 µg/mL.

Il secondo metodo è spettrofotometrico (o colorimetrico). In questo caso, non guardiamo la fluorescenza, ma l’assorbanza della luce. La formazione del complesso vericiguat-EB porta a un aumento dell’assorbanza a una lunghezza d’onda di 560 nm. Più vericiguat c’è, più il colore si intensifica e più luce viene assorbita. Questo metodo è risultato lineare per concentrazioni tra 0.5 e 10.0 µg/mL, con un LOD di 0.428 µg/mL e un LOQ di 1.298 µg/mL.

Insomma, abbiamo due frecce al nostro arco, una super sensibile per quantità piccolissime e una ottima per un range di concentrazioni più ampio.

Il Cuore Verde di Questi Metodi

Ora, la parte che mi entusiasma di più: l’aspetto “green”. Viviamo in un’epoca in cui la sostenibilità non è più un’opzione, ma una necessità. E anche la chimica analitica deve fare la sua parte. Questi metodi sono stati sviluppati seguendo i principi della Green Chemistry. Cosa significa in pratica?

• Niente solventi organici pericolosi: Uno dei grandi vantaggi è che non c’è bisogno di estrarre il farmaco con solventi tossici e inquinanti. Si usa principalmente acqua distillata come solvente! L’acqua è economica, disponibile ovunque e, ovviamente, super ecologica. Pensate che l’uso di solventi organici come etanolo o metanolo non solo non migliorava la formazione del complesso, ma a volte la ostacolava. L’acqua, con la sua alta costante dielettrica, si è rivelata la scelta vincente.
• Reazioni rapide e a temperatura ambiente: La reazione tra vericiguat ed eritrosina B è immediata e stabile per almeno un’ora, e avviene tranquillamente a temperatura ambiente (circa 25°C). Niente spreco di energia per riscaldare o raffreddare.
• Niente surfattanti: Sono stati testati anche dei surfattanti (sostanze che modificano la tensione superficiale), ma si è visto che non portavano benefici significativi alla formazione del complesso. Quindi, via un altro potenziale ingrediente chimico!

Per dare un “voto” all’ecologicità di questi metodi, sono stati usati due strumenti software specifici: il GAPI (Green Analytical Procedure Index) e l’AGREE (Analytical Greenness Calculator). Entrambi hanno confermato che i metodi proposti sono decisamente “verdi”. Il GAPI ha mostrato un pittogramma prevalentemente verde, con solo un paio di settori rossi dovuti al campionamento offline e ai rifiuti non trattati (ma parliamo di volumi minimi, circa 10 mL). L’AGREE ha dato un punteggio di 0.81 (su 1), con un bel nucleo verde nel suo grafico a 12 settori. Un ottimo risultato!

Validazione e Applicazione Pratica: Funzionano Davvero?

Sviluppare un metodo è una cosa, ma bisogna anche dimostrare che sia affidabile, preciso e accurato. Ebbene, questi metodi sono stati validati secondo le rigorose linee guida ICH Q2 (quelle dell’International Conference on Harmonisation, un punto di riferimento nel settore farmaceutico).

I risultati sono stati eccellenti:

• Precisione: Sia la precisione intra-giornaliera (misure ripetute nello stesso giorno) che quella inter-giornaliera (misure in giorni successivi) hanno mostrato valori di RSD (deviazione standard relativa) molto bassi, confermando l’alta precisione.
• Accuratezza: I metodi sono stati confrontati con un metodo spettroscopico già pubblicato, e i test statistici (t-test di Student e F-test) hanno dimostrato che non ci sono differenze significative. Questo significa che i nuovi metodi sono accurati quanto quelli esistenti, se non di più in certi aspetti.
• Robustezza: Piccole variazioni nei parametri sperimentali (come il pH del tampone o il volume dei reagenti) non hanno influenzato significativamente i risultati, il che è un segno di robustezza.
• Selettività: Forse uno degli aspetti più importanti per l’analisi di formulazioni farmaceutiche. Le compresse di Verquvo® contengono, oltre al principio attivo, vari eccipienti (amido di mais, lattosio, magnesio stearato, ecc.). Ebbene, questi metodi si sono dimostrati altamente selettivi: gli eccipienti non interferiscono con la determinazione del vericiguat. Questo è fondamentale per l’applicazione nel controllo qualità.

I metodi sono stati infatti applicati con successo all’analisi di compresse commerciali di Verquvo®, dimostrando la loro utilità pratica.

Uno Sguardo al Meccanismo: Come si Legano Vericiguat ed Eritrosina B?

Per i più curiosi, due parole sul meccanismo di reazione. Utilizzando il metodo di Job (una tecnica per studiare la stechiometria delle reazioni), si è scoperto che il complesso si forma con un rapporto di 2:1 tra eritrosina B e vericiguat. Questo significa che due molecole di eritrosina B si legano a una molecola di vericiguat.

A pH 4, l’eritrosina B (che è un acido debole diprotico) perde un protone principalmente dal suo gruppo ossidrilico sul nucleo xantenico (questo gruppo è più acido del gruppo carbossilico a causa degli atomi di iodio vicini, che sono elettron-attrattori). Così si forma un anione monovalente (carico negativamente). Il vericiguat, d’altro canto, in ambiente acido protona i suoi due gruppi amminici primari, diventando un catione (carico positivamente). L’attrazione elettrostatica tra l’anione dell’EB e il catione del VER, insieme a forze idrofobiche, porta alla formazione del complesso di coppia ionica. Questa interazione è anche responsabile della diminuzione della resa quantica di fluorescenza dell’EB, che passa dal 4.35% al 3.26% dopo l’aggiunta di vericiguat, confermando l’interazione.

In Conclusione: Un Passo Avanti per l’Analisi Farmaceutica

Quindi, cosa ci portiamo a casa da questa storia? Che a volte le soluzioni più eleganti sono anche quelle più semplici e rispettose dell’ambiente. L’uso dell’eritrosina B per l’analisi spettrofluorimetrica e spettrofotometrica del vericiguat rappresenta un notevole passo avanti. Abbiamo metodi:

• Semplici e rapidi
• Sensibili e selettivi
• Economici (l’EB e l’acqua non costano un occhio della testa!)
• Ecologici (e questo, per me, vale doppio!)

Questi approcci sono perfetti per il controllo qualità di routine del vericiguat nelle sue formulazioni farmaceutiche, garantendo che i pazienti ricevano un prodotto sicuro ed efficace, il tutto con un occhio di riguardo per il nostro pianeta. Non è fantastico quando la scienza riesce a essere così… “eco-chic”? Io credo proprio di sì!

Fonte: Springer