Tirotossicosi e Farmaci: La Mia Caccia all’Antidoto Perfetto (e Green!)

Ciao a tutti! Oggi voglio raccontarvi di un’avventura scientifica che mi ha tenuto impegnato per un bel po’, una di quelle sfide che ti fanno amare la ricerca. Parliamo di tirotossicosi, una condizione in cui la tiroide fa un po’ troppo la matta e produce ormoni a tutto spiano, e di come possiamo tenere sotto controllo i farmaci usati per calmarla, il tutto con un occhio di riguardo per il nostro pianeta. Sembra complicato? Forse un po’, ma vi assicuro che è affascinante!

Il Problema sul Tavolo: Metimazolo e Propranololo sotto la Lente

Allora, partiamo dalle basi. Quando la tiroide va in iperattività (iper-tiroidismo), uno dei farmaci chiave è il Metimazolo (MTZ). È un tipo di farmaco chiamato tionamide che, in pratica, dice alla tiroide: “Ehi, datti una calmata con la produzione di ormoni!”. Funziona alla grande per condizioni come il gozzo nodulare tossico o la tirotossicosi in generale. Spesso, insieme al MTZ, i medici prescrivono il Propranololo (PRP), un beta-bloccante che aiuta a tenere a bada la tachicardia, quel fastidioso batticuore accelerato che spesso accompagna l’ipertiroidismo. Una bella squadra, no?

Il punto è che, sebbene il MTZ sia un salvavita, un suo uso prolungato può portare a qualche effetto collaterale non proprio simpatico: parliamo di agranulocitosi (un calo drastico di globuli bianchi), epatite, artrite e sfoghi cutanei. Capite bene che diventa cruciale poter misurare con precisione quanto MTZ c’è nel plasma sanguigno di un paziente, specialmente quando sta assumendo anche il PRP. È come voler sapere esattamente quanto zucchero c’è nel caffè, anche se ci avete aggiunto il latte! Sorprendentemente, spulciando la letteratura scientifica, mi sono reso conto che non esisteva un metodo pubblicato per analizzare MTZ e PRP insieme nel plasma. Un bel rompicapo!

La Nostra Missione: Un Metodo Analitico Efficace ed Ecologico

Ecco che è scattata la scintilla: perché non sviluppare un metodo nuovo di zecca, che sia non solo accurato e sensibile, ma anche amico dell’ambiente? Sì, perché oggi non possiamo più permetterci di ignorare l’impatto ecologico delle nostre procedure di laboratorio. Così, ci siamo rimboccati le maniche e abbiamo puntato sulla cromatografia su strato sottile (TLC) con analisi densitometrica. La TLC è una tecnica fantastica: è relativamente semplice, non richiede strumentazioni da capogiro (e quindi è anche economica), è veloce e necessita di piccole quantità di campione. Perfetta per il nostro scopo!

L’obiettivo era ambizioso: separare e quantificare MTZ e PRP sia in forma pura che nel plasma umano “arricchito” con questi farmaci (un modo per simulare i campioni reali dei pazienti). E volevamo farlo seguendo le rigorose specifiche della US-FDA (Food and Drug Administration americana) per la validazione dei metodi bioanalitici.

La Ricetta Segreta: Trovare la “Fase Mobile” Perfetta

Come in ogni buona ricetta, anche in cromatografia gli ingredienti e le loro proporzioni sono fondamentali. Abbiamo provato diverse miscele di solventi (la cosiddetta “fase mobile”) per far correre i nostri farmaci su lastrine di gel di silice Merck®. Dopo vari tentativi, la combinazione vincente è stata una miscela di acetato di etile, acetone e una puntina di soluzione di ammoniaca al 33% (in proporzione 9:1:0.05, per i più tecnici). Questa miscela ci ha permesso di separare nettamente i picchi dei due farmaci e anche quelli derivanti dalla matrice plasmatica.

Per rendere le cose ancora più precise e per minimizzare le possibili variazioni dovute alla complessità del plasma, abbiamo introdotto un “aiutante” speciale: l’idrocortisone acetato (HCA) come standard interno. È un po’ come avere un punto di riferimento fisso in una gara, che ti aiuta a misurare meglio le prestazioni degli altri concorrenti. Alla fine, i nostri “corridori” si sono posizionati così sulla lastrina (valori di Rf, che indicano quanto hanno corso): plasma a 0.07, PRP a 0.19, MTZ a 0.67 e il nostro HCA a 0.81. Una separazione da manuale, rilevata con luce UV a 254 nm!

Abbiamo poi costruito le curve di calibrazione, che sono essenziali per tradurre l’area del picco rilevato in una concentrazione precisa del farmaco. I risultati sono stati eccellenti, con una linearità perfetta negli intervalli di concentrazione che ci interessavano, sia per i farmaci puri che per quelli “nascosti” nel plasma.

Semaforo Verde per l’Ambiente: Quanto è “Green” il Nostro Metodo?

Come vi dicevo, l’aspetto ecologico era una nostra priorità. Non basta che un metodo funzioni bene, deve anche essere sostenibile. Perciò, abbiamo sottoposto la nostra procedura TLC a ben quattro diversi sistemi di valutazione della “verdosità”:

• Eco-Scale Assessment (ESA): abbiamo ottenuto un punteggio di 80, che significa “accettabilmente verde”. Ottimo!
• Green Analytical Procedure Index (GAPI): questo strumento analizza l’intero processo, dalla raccolta del campione al risultato finale. Il nostro GAPI ha mostrato una predominanza di segmenti verdi e gialli, confermando il basso impatto ambientale.
• Analytical Greenness Metric Approach (AGREE): qui abbiamo totalizzato un punteggio di 0.73 (su una scala dove 1 è il massimo del verde), con un bel colore verde chiaro nel grafico risultante. Un’altra conferma!
• Practicability Metric Approach (BAGI): questo valuta la praticità del metodo. Con un punteggio di 75 e una tonalità azzurra chiara, abbiamo dimostrato che il nostro metodo non è solo green, ma anche pratico e fattibile.

Infine, abbiamo usato anche il sistema RGB (Red-Green-Blue) per valutare la “bianchezza” del metodo, che considera l’efficacia analitica (rosso), la sostenibilità (verde) e la praticità (blu). Il nostro metodo ha ottenuto un punteggio complessivo di “bianchezza” del 95%, il che significa che è ben bilanciato sotto tutti questi aspetti. Insomma, non solo abbiamo trovato un modo per misurare i farmaci, ma lo abbiamo fatto pensando anche al nostro pianeta!

Validazione FDA: La Prova del Nove

Un metodo analitico, specialmente se destinato ad applicazioni bioanalitiche, deve essere a prova di bomba. Per questo, abbiamo seguito scrupolosamente le linee guida della US-FDA. Abbiamo verificato:

• Specificità: il metodo riesce a distinguere nettamente i farmaci da altre sostanze presenti nel plasma, senza interferenze. E sì, ci siamo riusciti!
• Linearità, Limite Inferiore e Superiore di Quantificazione (LLOQ e ULOQ): abbiamo definito gli intervalli di concentrazione in cui il metodo è affidabile. Per il PRP, da 0.06 a 1.2 µg/banda, e per il MTZ, da 0.1 a 1.2 µg/banda nel plasma.
• Precisione e Accuratezza: analizzando campioni a concentrazioni note (Quality Control samples), abbiamo ottenuto recuperi vicinissimi al 100% (tra 100.39–104.44% per MTZ e 96.01–100.72% per PRP), con bassissimi valori di deviazione standard relativa (RSD). Questo significa che il metodo misura ciò che deve misurare, e lo fa in modo consistente.
• Stabilità: i farmaci sono risultati stabili nei campioni anche dopo cicli di congelamento e scongelamento e a temperatura ambiente per un certo periodo.
• Recupero dell’estrazione: abbiamo verificato che il nostro metodo di estrazione dei farmaci dal plasma fosse efficiente.
• Robustezza: abbiamo introdotto piccole variazioni volute nei parametri del metodo (come la composizione della fase mobile o la lunghezza d’onda di lettura) e abbiamo visto che i risultati rimanevano affidabili. Un metodo robusto è come una nave che tiene bene il mare anche con qualche onda!

Tutti i parametri di validazione hanno soddisfatto i criteri di accettazione della FDA. Un grande successo!

Cosa Rende Speciale il Nostro Metodo?

Confrontando il nostro approccio TLC con altri metodi cromatografici pubblicati in passato per la determinazione di PRP o MTZ (ma non insieme!) nel plasma, possiamo dire con orgoglio che il nostro ha diversi vantaggi. È più accurato di molti metodi riportati e più preciso di altri. Ma soprattutto, utilizza solventi per la fase mobile decisamente più “green” rispetto a metodi che impiegano cloroformio o acetonitrile (sostanze tossiche e poco amiche dell’ambiente). Questo dimostra che il nostro metodo è più sicuro sia per l’ambiente che per la salute umana.

Certo, ogni medaglia ha il suo rovescio: il nostro metodo potrebbe essere un pochino meno sensibile di alcune tecniche HPLC o GC super sofisticate, ma la sua semplicità, economicità, rapidità e, soprattutto, il suo bassissimo impatto ambientale lo rendono una scelta eccellente per molte applicazioni, specialmente considerando l’urgenza di monitorare il MTZ, data la sua potenziale tossicità a lungo termine e la sua azione sinergica con il PRP.

In conclusione, sono davvero entusiasta di aver contribuito a sviluppare questa tecnica TLC “verde” e sensibile per misurare simultaneamente PRP e MTZ. È la dimostrazione che si può fare scienza di alta qualità pensando anche alla sostenibilità. Un piccolo passo per il laboratorio, un grande passo (speriamo!) per un approccio più consapevole all’analisi farmaceutica. E chissà quali altre sfide ci aspettano dietro l’angolo!

Fonte: Springer